معلومة

8.9: DNA Miniprep بواسطة Alkaline Lysis (نشاط) - علم الأحياء

8.9: DNA Miniprep بواسطة Alkaline Lysis (نشاط) - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

تحلل قلوي

بمجرد إدخال الحمض النووي وحمله في البكتيريا ، نود عزل الحمض النووي مرة أخرى لمزيد من التلاعب. من أجل القيام بذلك ، يتم زراعة البكتيريا التي تحتوي على البلازميد المعني في مزرعة سائلة من مرق غني بالمغذيات مصنوع من مستخلص الخميرة يسمى Luria-Bertani Broth (رطل). تنمو هذه البكتيريا المستنبتة حتى تصبح بتركيز عالٍ بين عشية وضحاها. يتم حصادها عن طريق الطرد المركزي ويتم إزالة المرق. يتم تعليق الحبيبات الناتجة من البكتيريا في مخزن مؤقت فسيولوجي يحتوي على مادة مخلبة EDTA. أ خالب هي مادة كيميائية تزيل الكاتيونات ثنائية التكافؤ مثل الكالسيوم2+ أو Mg2+ من الحل. هذا مهم لأن الكاتيونات ثنائية التكافؤ ضرورية لكي تكون إنزيمات هضم الحمض النووي نشطة. عن طريق تخليب الأيونات ، فإن الحمض النووي الذي نرغب في تنقيته في النهاية سيكون في مأمن من التدهور.

بعد إعادة تعليق البكتيريا ، يتم خلط محلول قلوي من 0.1N هيدروكسيد الصوديوم في المزيج البكتيري. يحتوي هذا المحلول أيضًا على منظف أيوني يسمى كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) التي تساعد في تغيير طبيعة البروتينات وتعطيل تفاعلاتها مع الحمض النووي. يصبح الخليط لزجًا عندما تنفجر البكتيريا وتتسرب محتوياتها إلى المحلول. يتم بعد ذلك تحييد هذا المحلول الأساسي باستخدام محلول أسيتات البوتاسيوم عند درجة الحموضة 5.5. عندما تختلط المحاليل معًا ، يقترب الأس الهيدروجيني من 7 ويتفاعل البوتاسيوم مع SDS لإحداث ترسيب للحمض النووي والبروتينات الكروموسومية الجينية. من أجل فصل الراسب عن المحلول ، يتم طرد الخليط بسرعة عالية لتكوير الحمض النووي الجيني والبروتين. ال طاف، أو الحل ، إلى عمود يحتوي على أ غشاء السيليكا. في ظل ظروف الملح العالية ، يلتصق الحمض النووي بالزجاج أو السيليكا. عن طريق تمرير المحلول عبر هذا العمود ، يتم احتجاز DNA البلازميد الموجود في المادة الطافية على غشاء السيليكا وإزالته من المحلول. يتم استخدام غسالات إضافية لإزالة الملوثات الشاردة وإزالة الملح الزائد. يتم أخيرًا إزالة DNA البلازميد من العمود من خلال شطف بواسطة عازلة منخفضة الملح. هذا المخزن المؤقت منخفض الملح هو Tris pH 8 مع EDTA (TE). يمكن تخزين DNA البلازميد بشكل ثابت في المخزن المؤقت TE في الثلاجة لفترات طويلة.

التمرين 1: Plasmid DNA Mini-Prep بواسطة Alkaline Lysis

  1. تلقيح 2 مل من الوسط الغني (LB أو YT أو Terrific Broth) يحتوي على المضاد الحيوي المناسب مع مستعمرة واحدة من البكتيريا المحولة. احتضان الثقافة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي. (هذا ما تم توفيره لك)
    1. يجب أن تأخذ كل مجموعة ثقافتين
  2. جهاز الطرد المركزي أنابيب الثقافة مباشرة بحد أقصى 5 دقائق.
    1. إذا لم تكن قادرًا على الدوران في هذه الأنابيب ، فقم بنقل 1.5 مل من الثقافة إلى أنبوب دقيق (أنبوب إيبندورف).
    2. الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 30 ثانية.
  1. عند اكتمال الطرد المركزي ، اسكب محلول المرق في وعاء مبيض.
  2. إعادة التعليق الحبيبات البكتيرية في 250 ميكرولتر من محلول P1 المثلج عن طريق الاهتزاز القوي وإعادة النقل إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير.
  • P1 هو محلول فسيولوجي من 50 ملي مولار تريس عند الرقم الهيدروجيني 8.
  • يحتوي P1 على مخلّب يسمى EDTA.
    • تعمل الخالب على ربط الكاتيونات ثنائية التكافؤ الزائدة المطلوبة لنشاط DNAse.
  1. ليز: أضف 250 مايكرولتر من محلول P2 لكل معلق بكتيري. أغلق الأنبوب بإحكام ، واخلط المحتويات عن طريق قلب الأنبوب برفق خمس مرات. لا دوامة! قم بتخزين الأنبوب على الجليد.
  • هذا هو محلول التحلل الذي يحتوي على المنظف Sodium Dodecyl Sulfate و NaOH.
  1. إبطال مفعول: أضف 350 ميكرولتر من محلول P3 المثلج. أغلق الأنبوب وقم بتفريق محلول التحلل عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. قم بتخزين الأنبوب على الثلج لمدة 3-5 دقائق.
  • هذا هو المخزن المؤقت المعادل الذي يحتوي على خلات البوتاسيوم.
  • يعيد التحييد درجة الحموضة إلى ما يقرب من 7 ويسبب أيضًا ترسيب الحمض النووي الجيني والبروتينات في فوضى جلوبي (تشبه المخاط).
  1. الطرد المركزي المحللة البكتيرية بأقصى سرعة لمدة 5 دقائق في microfuge.
  • يجب تعبئة المواد الشبيهة بالمخاط بإحكام في حبيبات أسفل الأنبوب بعد هذه الخطوة.
  • يحتوي المحلول أو المادة الطافية على DNA البلازميد.
  1. تنقية العمود من الحمض النووي: نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد مع عمود غشاء السيليكا
  • يحب الحمض النووي الارتباط بالزجاج في ظروف الملح العالية.
  • الغشاء الأبيض مصنوع من الألياف الزجاجية.

  1. الطرد المركزي من خلال العمود طاف لمدة 1 دقيقة بأقصى سرعة في microfuge.
  • سيرتبط الحمض النووي بالغشاء الموجود على العمود (السيليكا)
  1. غسل: تجاهل التدفق من خلال وضع العمود مرة أخرى في أنبوب النفايات. يغسل العمود بـ 500 ميكرولتر من البولي إيثيلين. الطرد المركزي من خلال العمود طاف لمدة 1 دقيقة كحد أقصى في microfuge.
  • PE هو حل يساعد على غسل المواد غير المرتبطة على وجه التحديد
  1. تجاهل التدفق من خلال وضع العمود مرة أخرى في أنبوب النفايات. اغسل العمود بـ 700 ميكرولتر من البولي إيثيلين. الطرد المركزي لمادة طافية من خلال العمود لمدة 1 دقيقة كحد أقصى في microfuge. تجاهل التدفق من خلال وكرر الدوران إلى العمود الجاف.
  2. ضع العمود في أنبوب جهاز طرد مركزي جديد أزل الأحماض النووية في 50 ميكرولتر من TE (درجة الحموضة 8.0) عن طريق الارتباط لمدة دقيقة واحدة والدوران بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة.

تحديد DNA البلازميد

بمجرد عزل البلازميدات ، فإنها تتطلب تحديد الهوية. نواقل البلازميد لها تسلسلات معروفة وتم تعيين معالمها الرئيسية. إن معرفة تسلسل هذه القطع من الحمض النووي يعني معرفة مواقع مواقع هضم الطاقة المتجددة. باستخدام الدقة ، فإن هضم البلازميدات إلى أحجام معروفة يساعد في التحقق من هوية البلازميد دون الحاجة إلى إعادة تسلسل البلازميد بأكمله. يسمى البلازميد الشائع pUC18 أو pUC19. يرمز الحرف "p" إلى البلازميد ، بينما يرمز الحرف "UC" إلى جامعة كاليفورنيا (حيث تم تصميمه) ويشير 18 أو 19 إلى الاختلاف في MCS. يبلغ طول هذا البلازميد 2686 زوجًا أساسيًا أو 2.7 كيلو بايت تقريبًا (كيلو بايت) مع واحد ايكو ارى موقع في MCS. يسمى البلازميد الآخر المهتم بتعلم البيولوجيا الجزيئية pGlo. يحتوي هذا البلازميد على جين قنديل البحر في MCS يرمز إلى بروتين يتألق باللون الأخضر عند التعبير عنه تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. يبلغ طول pGlo 5.4 كيلو بايت ويحتوي على ملف ايكو ارى موقع. بمجرد هضمها بواسطة إنزيم ، يمكن التعرف على هذه البلازميدات بناءً على فصل الحجم على هلام الاغاروز. عادة ، من الأفضل التعرف على اثنين من مصادر الطاقة المتجددة. الهضم مهم قبل مقارنات الحجم لأن الحمض النووي الدائري ينتقل عبر الاغاروز بشكل مختلف عن الحمض النووي الخطي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون الحمض النووي الدائري أحيانًا "ملفوفًا للغاية" ويؤدي إلى هجرة سريعة جدًا على الرغم من الحجم.

خريطة ميزات pUC19 بما في ذلك مواقع بعض إنزيمات التقييد.

عرض عن قرب لموقع الاستنساخ المتعدد لـ pUC19 (MCS). تظهر مواقع التقييد هذه مرة واحدة فقط في كامل تسلسل البلازميد.

خريطة ميزة البلازميد لـ pGlo. هذا ليس متجه استنساخ ، لذلك لا توجد MCS.

التمرين 2: تحديد هضم تقييد البلازميدات

  1. يجب أن يقوم الفصل بإعداد 2 × 0.8 ٪ من المواد الهلامية من الاغاروز عن طريق تحضير 0.4 جرام من الاغاروز في محلول TBE سعة 50 مل.
    1. قم بإذابة محلول الاغاروز بالميكروويف لمدة 1 دقيقة.
    2. أضف 5 مايكرولتر من محلول Sybr الآمن إلى محلول جل 100 مل.
    3. صب هذا المحلول في صينية صب داخل الثلاجة.
    4. أدخل المشط.
  2. إلى أنبوب جديد أضف 2 مايكرولتر من DNA البلازميد إلى 8 ميكرولتر من سابقة بمعنى البيئةخليط سريع الهضم.
    1. 1 ميكرولتر عازلة سريعة الهضم
    2. 1 ميكرولتر سريع الهضم سابقة بمعنى البيئةإنزيم RI
    3. 6 ميكرولتر H.2ا
  3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. أضف 2 مايكرولتر من محلول التحميل إلى خليط الهضم.
  5. في أنبوب منفصل ، اجمع 3 ميكرولتر من DNA البلازميد مع محلول تحميل 2 ميكرولتر و 7 ميكرولتر من H.2س.
  6. قم بتحميل الجل باستخدام سلم بحجم مناسب في الممر الأول ، وقم بتحميل البلازميد المهضوم في الممرات التالية ، ثم قم بتحميل البلازميد غير المهضوم.
    • يمكن تحميل 3 مجموعات على هلام واحد
    • D = هضم البلازميد
    • U = بلازميد غير مهضوم
  7. قم بتشغيل الجل على 110 فولت لمدة 30 دقيقة وتصور على ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
  8. وثق بالكاميرا الخاصة بك.

مصادر إضافية

  • للمساعدة في هذه المشكلة ، يرجى تجربة في السيليكو نشاط الهضم.

أولاً ، البلازميد هو جزيء DNA الدائري المنفصل عن الكروموسوم ، القادر على إعادة إنتاج نفسه. يتم إجراء استخلاص البلازميد بطريقة التحلل القلوي. المبدأ الأساسي: يتعرض المعلق البكتيري في سلفات ألكيلبيزين الخطية القوية عالية الحموضة. بعد ذلك ، يتحلل جدار الخلية بالحرارة. الحمض النووي للكروموسوم يفسد بالبروتين. تتشابك لتشكل معقدًا كبيرًا يتم تغطيته بعد ذلك بواسطة دوديسيل كبريتات. عندما يتم استبدال أيون البوتاسيوم بأيون الصوديوم ، فإن المعقد سوف يترسب في المحلول. بعد الطرد المركزي للحمض النووي المعقد ، يوجد DNA البلازميد في المادة الطافية. الحمض النووي مشحون سالبًا ، في حين أن عمود استخراج البلازميد يعادل عمود الأنيون ويمكن أن يمتص الحمض النووي في حالة ارتفاع الملح. بعد التصفية من العمود بواسطة الماء منزوع الأيونات ، يتم الحصول على DNA البلازميد المنقى.

يهدف بشكل رئيسي إلى تعليق البكتيريا. Tris-HCl هو محلول عازل يحافظ على الرقم الهيدروجيني لنظام التفاعل ثابتًا EDTA-Na2 هو عامل مخلب معدني ، يعمل على ربط أيونات المعادن في الكائنات الحية الدقيقة وتثبيط نشاط DNAse الجلوكوز يمكن أن يحسن لزوجة المحلول ، ويحافظ على التعليق البكتيري ويؤخر وقت الترسيب. يجب التحقق من صحة إضافة RNAse A أثناء استخدام الحل I. يهدف RNAse A إلى القضاء على RNA. إذا لم يتم خلط البكتيريا تمامًا ، فسوف يتأثر التحلل. ومن ثم ، فإن تركيز البلازميد المستخرج منخفض للغاية. نظرًا لأن إنزيم RNA ينتمي إلى البروتين ، يجب تخزين المحلول I الذي يحتوي على RNase A في درجة حرارة منخفضة (4 درجات مئوية) بسبب ضعف استقرار البروتين.


الملخص

أبلغنا عن تطوير نشاط مخبري لمدة 3 أسابيع لدورة البكالوريوس في البيولوجيا الجزيئية. يعرّف هذا النشاط الطلاب على ممارسة التقنيات الجزيئية الأساسية مثل هضم إنزيم التقييد ، ورحلان هلام الاغاروز الكهربائي ، والاستنساخ ، وتنقية الحمض النووي للبلازميد ، والنشاف الجنوبي ، والتسلسل. يتعلم الطلاب كيفية إجراء بحث GenBank ™ حيث يتم تشجيعهم على تجميع معظم المعلومات المتاحة حول تسلسلهم المستنسخ. يعتبر التكامل الطبيعي لعمل مقاعد البدلاء مع استخدام أدوات المعلوماتية الحيوية ميزة رئيسية لهذه الدورة المختبرية.

تتكون نسبة كبيرة من جينومات حقيقيات النوى من الحمض النووي المتكرر [1]. غالبًا ما يُصنف الحمض النووي المتكرر إلى نوعين عامين ، الحمض النووي عالي التكرار ومتوسط ​​التكرار. على الرغم من أن الحمض النووي شديد التكرار يتكون من متواليات قصيرة تتكرر عادةً كمصفوفة ترادفية وترتبط عمومًا بالمناطق الخاملة من الكروموسومات ، فإن الحمض النووي المتكرر بشكل معتدل يتشتت في جميع أنحاء الجينوم في شكل عائلات ذات تسلسلات ذات صلة وليست متطابقة (للحصول على نظرة عامة ، انظر المرجع) 2). تمثل عائلتان معظم هذه المواد المتكررة بشكل معتدل: التسلسلات الطويلة المتقطعة (LINES) 11 1 الاختصارات المستخدمة هي: LINES ، التسلسلات الطويلة المتقطعة SINES ، المتواليات القصيرة المختلطة EtBr ، بروميد الإيثيديوم LB ، Luria-Bertani IPTG ، الأيزوبروبيل -1-ثيو -β- د -جالاكتوبيرانوسيد X-gal ، 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-β- D -galactopyranoside. والمتواليات القصيرة المختلطة (SINES) [3].

نشاط معمل لمدة 3 أسابيع يعتمد على الاستنساخ وتحليل الحمض النووي المتكرر من الفأر (موس العضلات) الجينوم هنا ، والذي تم عقده لمدة 5 سنوات كجزء من دورة البيولوجيا الجزيئية لكلية العلوم في مونتيفيديو ، أوروغواي. دورة البيولوجيا الجزيئية ، والتي تتكون أيضًا من محاضرات وجلسات مناقشة ورقية ، بالإضافة إلى النشاط المخبري ، موجهة للطلاب في الفصل السابع من خطط الحصول على درجات علمية في علم الأحياء والكيمياء الحيوية في كليتنا. كما أنه بمثابة دورة تنشيطية للطلاب من الكليات الأخرى الراغبين في الحصول على درجات عليا في علم الأحياء أو الكيمياء الحيوية في كلية العلوم.

استند اختيار التسلسل المتكرر كموضوع للنشاط المخبري إلى الأسباب التالية: 1) عندما يتم هضم الحمض النووي لجينوم حقيقيات النوى باستخدام إنزيمات تقييدية ، يمكن إثبات الحمض النووي المتكرر كعصابات حادة بعد الرحلان الكهربائي للهلام [4] . يمكن استئصال تلك العصابات ، التي تحتوي على كمية عالية من الحمض النووي ، من المواد الهلامية واستنساخها بسهولة ، وبالتالي فإن الحمض النووي المتكرر هو مادة مثالية للطلاب الذين يتعلمون استنساخ الحمض النووي لأول مرة. 2) لقد كانت تسلسلات الحمض النووي المتكررة موضوع اهتمام متجدد حيث تم تورطها في تنظيم التعبير الجيني [5 ، 6] ، ونمذجة الجينومات ، وحتى الأمراض (انظر "النتائج والمناقشة") ، وبالتالي أصبحت موضوع دراسي جذاب. 3) يتيح توافر معلومات الجينوم الكاملة للطلاب إجراء تحليلات المعلوماتية الحيوية على المستوى الجيني وليس فقط عمليات البحث عن هوية الجين إلى الجين. التحقيقات في المبلغ والتوزيع (على سبيل المثال بين الكروموسومات) ، ويمكن أن يساعد موقع العناصر المتكررة في إنشاء فرضيات حول أهمية تلك التسلسلات.

يسترد هضم جينوم الفأر باستخدام EcoRI ، وهو أحد أكثر إنزيمات التقييد المتاحة شيوعًا وأقل تكلفة ، نطاقًا من الحمض النووي يكون مرئيًا بوضوح وله حجم جيد لكونه موضوعًا للاستنساخ (حوالي 1400 نقطة أساس). حفزنا ذلك على اختيار الحمض النووي للفأر كمواد أولية. إلى جانب ذلك ، يعد الفأر أكثر نماذج الثدييات استخدامًا في الأبحاث البيولوجية (على سبيل المثال ، يتم إجراء معظم عمليات الضربة القاضية للجينات في الفئران). يعد إكمال التسلسل الجيني للفأر [7] وإمكانية مقارنة النتائج مع جينومات الثدييات الأخرى المتسلسلة تمامًا مثل الإنسان [8 ، 9] والفئران [10] مزايا إضافية لاستخدام الفأر كنموذج.

نظرًا لأن مجموعة التقنيات في البيولوجيا الجزيئية تتزايد باستمرار ، فمن المستحيل استكشاف جميع التقنيات المتاحة في فصل دراسي واحد. ومع ذلك ، كان أحد اهتماماتنا الرئيسية هو تصميم نهج معمل يشتمل على مجموعة متنوعة من تقنيات البيولوجيا الجزيئية الأساسية. كان الهدف الثاني هو السماح للطلاب بدمج عمل المختبر مع أدوات المعلوماتية الحيوية الحديثة.

يحرك التمرين المخبري المقدم هنا الطلاب من خلال تطوير مشروع بحث نموذجي في البيولوجيا الجزيئية ، مما يسمح لهم باكتشاف العملية الفكرية المعنية. أثناء القيام بذلك ، تتاح للطلاب الفرصة لممارسة عدد مهم من تقنيات بحث الحمض النووي الأساسية والتعرف على أساسياتهم الكيميائية والفيزيائية. تكتمل التجربة باتباع نهج لأدوات المعلوماتية الحيوية الأكثر شيوعًا ، والتي تعد ضرورية في الوقت الحاضر للبحث الجينومي. يحدث تكامل عمل البدلاء والمعلوماتية الحيوية بشكل طبيعي لأن المعلوماتية الحيوية تساعد في تحليل وتفسير النتائج التجريبية.


النتائج

عزل BTF-37.

تم عزل BTF-37 في أ باكتيرويدس-إلى-باكتيرويدس تصفية التزاوج باستخدام ناقل المكوك غير القابل للحركة pGAT400 & # x00394BglII. pGAT400 & # x00394Bglتم إدخال II (الذي يحمل علامات لمقاومة الكليندامايسين والأمبيسيلين ومقاومة التتراسيكلين الهوائية) في باء الهشة السريرية العزلة LV23 عن طريق الاقتران من بكتريا قولونية HB101 (pRK231) (63). pGAT400 & # x00394Bglالثاني يحتوي على pRK231 oriT المنطقة ، مما يسمح بالتعبئة فيها عبر بواسطة بروتينات التعبئة pRK231 ، ويستخدم جهاز نقل pRK231 للانتقال إلى باكتيرويدس متلقي. بمجرد التواجد في باكتيرويدس، pGAT400 & # x00394BglII لا يمكن نقلها ما لم تحصل على الحمض النووي في رابطة الدول المستقلة التي تؤوي oriT وجين (جينات) التعبئة. تم استخدام هذه الخاصية سابقًا لعزل عوامل النقل الأخرى بنجاح (43 ، 63). باء الهشة LV23 يحمل pGAT400 & # x00394Bglتم تحفيز II عن طريق المعالجة المسبقة لخلايا المتبرع بـ 1 & # x003bcg من التتراسيكلين / مل وتزاوج مع أي منهما باء الهشة TM4000 أو ب. thetaiotaomicron BT4001 كمتلقي. يخلو كلا المستلمين من عناصر Tet أو عوامل النقل المعروفة الأخرى. تم اختيار المواد المتقاربة على التتراسيكلين لتعظيم فرص استعادة مقاومة التتراسيكلين اللاهوائية ومقاومة الكليندامايسين. يُظهر الجدول & # x200B Table2 2 ترددات النقل لمتحولات التتراسيكلين- و clindamycin المقاومة. كشف تحليل إنزيم التقييد للحمض النووي البلازميدي المعزول بشكل مستقل (الشكل & # x200B (الشكل 1) 1) أن عمليات إدخال الحمض النووي الكبيرة والصغيرة قد حدثت في pGAT400 & # x00394BglII. على الرغم من اختلاف أنماط التقييد بين المتحولون المستقلون المختلفون وبين التزاوجات ، كان حجم إدخال الحمض النووي الكبير دائمًا حوالي 37 كيلو بايت. كان حجم إدخال الحمض النووي الصغير دائمًا حوالي 5 كيلو بايت ، ونمط التقييد يتوافق مع نمط الينقولات القابلة للتعبئة التي تم تمييزها سابقًا.5520 (63). بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء تجارب التزاوج في مراحل مختلفة من نمو المتبرع لتحديد ما إذا كان حجم الإدخال يعتمد على النمو وما إذا كان Tn5520 أو سيتم عزل الإدخال الكبير بشكل تفضيلي في مرحلة نمو مبكرة أو لوغاريتمية أو ثابتة. لوحظ أنه تم التقاط إدخالات كبيرة في pGAT400 & # x00394BglII بغض النظر عن مرحلة نمو الثقافة. الحمض النووي 37 كيلو بايت المكتسب حديثًا في pGAT400 & # x00394Bglتم تعيين II لأحد المتحولين (BTF-37) باستخدام تحليل التقييد (الشكل & # x200B (الشكل 2). 2). حدث الإدراج في 3.5 كيلو بايت سابقة بمعنى البيئةRI-PSTأنا جزء من pGAT400 & # x00394BglII وقاطع pRK231 oriT منطقة. يبدو أن بقية ناقل الالتقاط لم يتغير. تم حساب حجم BTF-37 ليكون حوالي 50 كيلو بايت ، مع إدراج الحمض النووي الذي يمثل حوالي 37 كيلو بايت. تم تأكيد هذا البلازميد الجديد للتعبير عن مقاومة التتراسيكلين والكليندامايسين في ظل الظروف اللاهوائية والتتراسيكلين والأمبيسلين في ظل الظروف الهوائية. يشير هذا إلى أنه تم الحصول على النمط الظاهري لمقاومة التتراسيكلين اللاهوائية وأن tetX & # x0002a, بلوخ، و ermF جينات pGAT400 & # x00394Bglالثاني قد تم الإبقاء عليه.

خريطة قيود BTF-37. الإدراج في pGAT400 & # x00394Bglالثاني حدث في pRK231 oriT في 3.5 كيلوبايت PSTأنا-سابقة بمعنى البيئةجزء RI. ه ، سابقة بمعنى البيئةRI H ، هينdIII P ، PstI S ، ساو3AI.

الجدول 2.

خصائص عزل ونقل BTF-37

نوع التزاوججهات مانحةمتلقيتكرر أ
سيطرة سلبيةباء الهشة TM4000باء الهشة TM4290
باء الهشة TM4000 (Tn5520)باء الهشة TM4290
ب. thetaiotaomicron BT4001 (pGAT400 & # x00394BglII)باء الهشة TM4290
ب. thetaiotaomicron BT4001 (Tn5520)باء الهشة TM4290
باء الهشة TM4000 (Tn5520)بكتريا قولونية HB1010
ب. thetaiotaomicron BT4001 (pGAT400 & # x00394BglII)بكتريا قولونية HB1010
بكتريا قولونية HB101 (pBR328)بكتريا قولونية DW10300
مراقبة إيجابيةباء الهشة TM4.23 (Tn5520)باء الهشة TM4292.9 & # x000d7 10 & # x022125
باء الهشة TM4.23 (Tn5520)بكتريا قولونية HB1011.6 & # x000d7 10 & # x022122
بكتريا قولونية HB101 (R751 & # x0002b Tn5520)بكتريا قولونية DW10304.5 & # x000d7 10 & # x022121
عزل BTF-37 في باكتيرويدس النيابة.باء الهشة م 23باء الهشة TM40003.9 & # x000d7 10 & # x022124
باء الهشة م 23ب. thetaiotaomicron BT40011.4 & # x000d7 10 & # x022126
BTF-37 التحويلات الذاتية داخل باكتيرويدس النيابة.باء الهشة TM4000 (BTF-37)باء الهشة TM4291.8 & # x000d7 10 & # x022126
ب. thetaiotaomicron BT4001 (BTF-37)باء الهشة TM4291.3 & # x000d7 10 & # x022127
التحويلات الذاتية BTF-37 من باكتيرويدس ص. إلى بكتريا قولونيةباء الهشة TM4000 (BTF-37)بكتريا قولونية HB1011.4 & # x000d7 10 & # x022126
ب. thetaiotaomicron BT4001 (BTF-37)بكتريا قولونية HB1011.8 & # x000d7 10 & # x022126
BTF-37 التحويلات الذاتية داخل بكتريا قولونيةبكتريا قولونية HB101 (BTF-37)بكتريا قولونية DW10304.5 & # x000d7 10 & # x022127

BTF-37 داخل باكتيرويدس النيابة. و ل بكتريا قولونية.

خصائص نقل BTF-37 داخل مختلفة باكتيرويدس تم تقييم الأنواع باستخدام تجارب الاقتران. تم استخدام متحولات BTF-37-harboring TM4000 أو BT4001 كمانحين في تجارب التزاوج مع حساسية التتراسيكلين باء الهشة المستلم TM429. TM4000 و BT4001 نفسها خالية من عوامل النقل ولا تسهل النقل. كعنصر تحكم إيجابي ، قمنا بتقييم نقل Tn transposon القابل للتعبئة5520 (تم التقاطها في pGAT400 & # x00394BglII) من سلالة Tet المحتوية على عنصر TM4.23 (63). لوحظ أن BTF-37 يتطلب تحريض التتراسيكلين ونقله بكفاءة من TM4000 إلى TM429 (1.8 & # x000d7 10 & # x022126) وأن هذا التردد كان أقل قليلاً من ذلك بالنسبة للتحكم الإيجابي ، Tn5520 (2.9 & # x000d7 10 & # x022125 جدول & # x200B جدول 2). 2). كان تردد النقل من BT4001 أقل إلى حد ما ولكنه قابل للتكرار (1.3 & # x000d7 10 & # x022127). خضع الحمض النووي المترابط من التزاوجات لتحليل إنزيم التقييد (البيانات غير معروضة) لتأكيد أن BTF-37 لم يتغير.

اختبرنا أيضًا TM4000 و BT4001 إيواء BTF-37 كمانحين في تجارب التزاوج مع بكتريا قولونية HB101 لتقييم ما إذا كان BTF-37 قادرًا على النقل الذاتي من باكتيرويدس النيابة. إلى بكتريا قولونية. نقل تين5520 من التي تحتوي على عنصر تيت باء الهشة تم استخدام سلالة TM4.23 كعنصر تحكم إيجابي ، كما هو موضح أعلاه. لاحظنا أنه عند تحريض التتراسيكلين ، تم نقل BTF-37 من كل من TM4000 و BT4001 إلى HB101 بترددات 1.4 & # x000d7 10 & # x022126 و 1.8 & # x000d7 10 & # x022126 ، على التوالي (الجدول & # x200B (الجدول 2). 2). تم تأكيد وجود BTF-37 سليم في المتحولين HB101 من خلال تحليل إنزيم التقييد (غير معروض).

BTF-37 داخل بكتريا قولونية.

تم اختبار متحول واحد HB101 (BTF-37) ، تم الحصول عليه من التزاوج الموصوف سابقًا ، لقدرته على نقل نفسه إلى بكتريا قولونية المستلم DW1030. تم استخدام HB101 (R751) كعنصر تحكم إيجابي للنقل الذاتي. نقل BTF-37 نفسه (بدون بلازميد مساعد وبدون تحريض التتراسيكلين) بداخله بكتريا قولونية بتردد أقل ، ولكن يمكن اكتشافه بشكل متكرر (4.5 & # x000d7 10 & # x022127) من عنصر التحكم الإيجابي ، R751. أعطت ما مجموعه ثلاثة مواجهات نتائج مماثلة. أدت تجربة التزاوج باستخدام HB101 المحولة باستخدام DNA البلازميد BTF-37 إلى ترددات نقل مماثلة. في المقابل ، لم يُشاهد أي انتقال من عنصر التحكم السلبي ، HB101 (pBR328). خضعت المتحولات DW1030 (BTF-37) لتحليل إنزيم التقييد لإثبات أن BTF-37 لم يتغير بعد النقل إلى المستلم (غير موضح).

تينيسي5520 مرتبط بـ BTF-37.

لقد سبق أن وصفنا العزلة وتوصيف باء الهشة ينقولات قابلة للتعبئة Tn5520 (63). منذ باء الهشة كانت سلالة المضيف المستخدمة لعزل BTF-37 ، LV23 ، هي نفسها المستخدمة لاستعادة Tn5520 وبما أن الإدخالات الصغيرة التي تم التقاطها في بعض المتحولين تتوافق مع Tn5520 (انظر & # x0201cIsolation of BTF-37 & # x0201d أعلاه) ، حققنا فيما إذا كان Tn5520 تم ربطه بعمليات استحواذ كبيرة الحجم بواسطة pGAT400 & # x00394BglII. بحثنا باء الهشة TM4000 (BTF-37) ، بكتريا قولونية HB101 (BTF-37) و بكتريا قولونية DW1030 (BTF-37) بواسطة تهجين المستعمرة باستخدام Tn5520-مسبار محدد لتحديد ما إذا كان Tn5520 كانت حاضرة في BTF-37 وتم نقلها مع. يوضح الشكل & # x200B الشكل 3 3 أن Tn5520 هو جزء من جميع المستعمرات البكتيرية المأوى لـ BTF-37 التي تم اختبارها ويتم الاحتفاظ بها أثناء النقل من الداخل ومن باكتيرويدس النيابة. (تم اختبار 23 ترانسكونجوجانتس). وجود تين5520 تم تأكيده أيضًا من خلال تضخيم PCR للأجزاء الداخلية من Tn5520 بيف (ينقل) و bmpH (تعبئة) جينات لثمانية متحولين (غير معروض).

تينيسي5520 مرتبط بـ BTF-37. تم إجراء التزاوج باستخدام باء الهشة LV23 ، ب. thetaiotaomicron، أو بكتريا قولونية HB101 ، جميعها تؤوي BTF-37 كمانح ، و باء الهشة TM4000 ، بكتريا قولونية HB101 أو بكتريا قولونية DW1030 كمتلقي. (أ) 3 كيلو بايت طن5520-محدد Ddeأنا جزء يتضمن bipH (ينقل) و bmpH تم استخدام جينات (التعبئة) كمسبار لتهجين المستعمرة للحمض النووي المترابط الكلي. (ب) تم اختبار عشرة من المتحولين من كل تزاوج (من أ إلى ي) ، باستثناء بكتريا قولونية-إلى-بكتريا قولونية التزاوج ، حيث تم اختبار 3 متحولون. يتم عرض مثال على عنصر تحكم سلبي (TM4000). BT4001 و بكتريا قولونية السلالات وحدها لم تظهر أي إشارة تهجين مع المسبار (غير معروض).

تعبر الخلايا التي تؤوي BTF-37 عن هياكل سطح خلية تشبه القضيب في باكتيرويدس النيابة. و بكتريا قولونية.

يقوم أعضاء من العديد من الأجناس البكتيرية بتشفير هياكل سطح الخلية الخاصة بالاقتران ، ولا سيما بيلي. بناءً على ملاحظتنا السابقة بأن BTF-37 كانت قابلة للتحويل ذاتيًا في باكتيرويدس النيابة. و بكتريا قولونية، قمنا بتصور خلايا مأوى BTF-37 باستخدام المسح الضوئي ونقل EM لتحديد ما إذا كان من الممكن وجود أي هياكل سطحية تشبه تلك المتورطة في الاقتران في البكتيريا الأخرى. باكتيرويدس و بكتريا قولونية تمت مقارنة السلالات التي تحتوي على BTF-37 بثلاث سلالات تحتوي على عنصر Tet ، بالإضافة إلى سلالة التحكم TM4000 ، والتي تخلو من عناصر Tet. في ظل ظروف التزاوج (على سبيل المثال ، تحريض التتراسيكلين 6 ساعات على مرشحات التزاوج) ، ولكن في حالة عدم وجود متلقين ، ما يقرب من 10 إلى 15 & # x00025 من LV23 ، بالإضافة إلى TM4000 (BTF-37) ، تم التعبير عن الهياكل السطحية الشبيهة بالأنبوبية (الشكل . & # x200B (الشكل 4 أ). 4 أ). كان القطر الخارجي للبنى يتراوح من 25 إلى 50 نانومتر تقريبًا ويبدو دائمًا أنه متصل بالخلايا المجاورة. على عكس LV23 والخلايا الأخرى التي تؤوي BTF-37 ، فإن سلالة TM4000 التي تفتقر إلى عنصر Tet والتي تفتقر إلى النقل لم تعبر عن هياكل سطحية يمكن ملاحظتها. تمت أيضًا دراسة ثلاث عزلات إكلينيكية غير مرتبطة بعناصر Tet (LV22 و LV25 و LV43) ووجد أنها تعبر عن هياكل مشابهة لتلك التي لوحظت في سلالات LV23 و BTF-37 (الشكل 4 ب). . 4 ب). تم تأكيد هذه النتائج أيضًا باستخدام الإرسال EM لـ TM4000 (BTF-37) (الشكل & # x200B (الشكل 5) ، 5) ، مما يدل على وجود بنية سطح الخلية. شوهد التعبير عن الهياكل الشبيهة بالبيلوس في LV23 و TM4000 (BTF-37) يحدث فقط عند تحريض التتراسيكلين (الشكل. & # x200B (الشكل 6A). 6A). عندما تم تصور الخلايا في نقاط زمنية سابقة للتزاوج (4 مقابل 6 ساعات) ، شوهد العديد من أقصر & # x0201cspikes & # x0201d يشع من أسطح الخلايا ، أحيانًا في التعلق بالخلايا الأخرى. في وقت التزاوج المتأخر (6 ساعات) ، تم استبدال هذه المسامير بهيكل واحد أطول يشبه بيلوس (الشكل 6 ب وج). على غرار ما تم العثور عليه لـ BTF-37 ، فإن هذا التعبير عن الهياكل السطحية عند نقطة زمنية أقصر حدث أيضًا فقط في ظل ظروف تحريض التتراسيكلين.

الكشف عن هياكل سطح الخلية باستخدام المسح الكهرومغناطيسي. تعرضت جميع السلالات لتحريض التتراسيكلين و 6 ساعات من الحضانة على مرشحات التزاوج (انظر المواد والطرق). (أ) عزل سريري LV23 ، تحكم من النوع البري TM4000 ، و TM4000 يؤوي BTF-37. السهام ، هياكل تشبه بيلوس. (ب) سلالات أخرى تحتوي على عنصر تيت. التكبير ، & # x000d737000 إلى 43000. تم عرض جميع العينات عند 15 كيلو فولت. تمثل اللوحات تصورًا لما لا يقل عن 1000 خلية لكل عينة و 8 إلى 10 حقول تم تصويرها. ما يقرب من 10 إلى 15 & # x00025 من الخلايا تعبر عن بنية السطح. الحانات ، 200 نانومتر.

صورة مجهرية إلكترونية لنقل الحركة من TM4000 (BTF-37). يمكن رؤية قناة مركزية محتملة في هيكل يشبه بيلوس. تمثل اللوحة ما لا يقل عن 2000 خلية تم تصورها للعينة وستة حقول تم تصويرها. ما يقرب من 1 & # x00025 من الخلايا المرئية تعبر عن بنية سطح الخلية. التكبير (بعد تصحيح حجم الصورة) ، & # x000d 754000.

(أ) يتم التعبير عن هياكل سطح الخلية عند تحريض التتراسيكلين لـ LV23 و TM4000 (BTF-37). (B و C) تختلف أطوال هياكل سطح الخلية اعتمادًا على الوقت الإجمالي لمرشحات التزاوج. تم الحصول على نتائج مماثلة لـ LV23 و TM4000 (BTF-37). التكبير ، & # x000d737000 إلى 43000. تم عرض جميع العينات عند 15 كيلو فولت. تمثل اللوحات تصورًا لما لا يقل عن 1000 خلية لكل عينة و 8 إلى 10 حقول تم تصويرها. الحانات ، 200 نانومتر. السهام ، هياكل تشبه بيلوس.

بكتريا قولونية عبر HB101 المحتوي على BTF-37 أيضًا عن هياكل أنبوبية مشابهة شكليًا لتلك المشفرة بواسطة باكتيرويدس ص. سلالات و بكتريا قولونية البلازميدات واسعة النطاق R751 (الشكل & # x200B (الشكل 7) 7) و RK231 (غير معروض). لم تؤثر المعالجة المسبقة بالتتراسيكلين على التعبير عن هذه الهياكل في بكتريا قولونية. لا توجد هياكل تشبه بيلوس بكتريا قولونية تم تصور HB101 وحده.

بكتريا قولونية HB101 يؤوي BTF-37 يعبر عن هياكل سطح خلية تشبه بيلوس. (أ) HB101 ، بدون بلازميد. (B) HB101 (BTF-37) و HB101 (R751) (بلازميد R قابل للتحويل ذاتيًا) كعنصر تحكم. السهام ، هياكل تشبه بيلوس. التكبير ، & # x000d737000 إلى 43000. تم عرض جميع العينات عند 15 كيلو فولت. تمثل اللوحات تصورًا لما لا يقل عن 1000 خلية لكل عينة و 8 إلى 10 حقول تم تصويرها. شريط ، 200 نانومتر.

تسلسل الحمض النووي الجزئي لـ BTF-37.

تم استنساخ BTF-37 في بكتريا قولونية ناقلات الاستنساخ pBR322 as ساو3 شظايا AI. تم اختيار أربعة و 8 كيلو بايت بشكل عشوائي لبدء تسلسل الحمض النووي لـ BTF-37. كشفت تحليلات بيانات التسلسل الأولية من هذه النُسَخات الفرعية أن tetQ و rte كانت الجينات موجودة ، إلى جانب ORFs التي أظهرت منتجات الترجمة المتوقعة تشابهًا مع Bacteroides vulgatus تينيسي4555 TnpA transposase (8-kb subclone 28 & # x00025 هوية و 47 & # x00025 تشابه أكثر من 172 من الأحماض الأمينية) ، فولجاتوس plasmid القابل للتعبئة pIP417 المنتج RepA (8-kb subclone 27 & # x00025 هوية و 48 & # x00025 تشابه أكثر من 147 من الأحماض الأمينية) ، و سابقة بمعنى البيئةإنزيم تقييد E / A (4-kb subclone 43 & # x00025 هوية و 62 & # x00025 تشابه أكثر من 171 من الأحماض الأمينية). بالإضافة إلى ذلك ، نسخة شبه كاملة من باء الهشة تسلسل الإدراج هو4351 (1.1 كيلو بايت) في النسخة الفرعية 8 كيلو بايت في اتجاه مجرى النهر tnpA متماثل.


مناقشة

لقد طورنا العديد من استراتيجيات "النوافذ المنبثقة / المنبثقة" ذات الخطوتين لتحرير الجينوم الدقيق في الداخل تيرت locus ، الذي سمح لنا بتسمية بروتين TERT بعلامة حلقية طرفية N وتسهيل تعديلات زوج القاعدة الفردي في تيرت المروجين. باستخدام الخلايا التي تم تعديلها بهذه الإستراتيجية ، حققنا اكتشاف بروتين TERT و IP لتيلوميراز بكفاءة غير مسبوقة ، وأثبتنا أن التيلوميراز كان قابلاً للاكتشاف فقط عند 5-7٪ من التيلوميرات في أي وقت في المرحلة S. قمنا أيضًا بتصحيح مرض مرتبط بالسرطان تيرت طفرة محفزة في خط خلية سرطان الظهارة البولية وأظهرت أن مستوى التيلوميراز ومعدل نمو هذه الخلايا السرطانية قد انخفض.

استراتيجيات لتحرير الجينوم الدقيق في المواقع الداخلية بكفاءة استهداف منخفضة

يوفر تحرير الجينوم بوساطة CRISPR-Cas9 طريقة سهلة وسريعة لإدخال تعديلات مستهدفة في الجينوم البشري. ومع ذلك ، تختلف كفاءة الاستهداف اختلافًا كبيرًا بين مختلف المواقع [26]. عندما حاولنا استخدام تحرير الجينوم بوساطة CRISPR-Cas9 لدراسة بيولوجيا التيلوميراز ، وجدنا تيرت لتكون أحد المواقع ذات كفاءة استهداف منخفضة. لأن تيرت ليس جينًا مكتوبًا بنشاط كبير ، فقد تمنع بيئة الكروماتين الخاصة به الوصول إلى مجمع Cas9-sgRNA. تفسير آخر محتمل هو أن محتوى GC العالي حول تيرت قد تمنع منطقة 5 التعرف على الهدف بواسطة مجمع Cas9-sgRNA - على سبيل المثال ، بسبب صعوبة ذوبان الحمض النووي أو لأنه شكل هياكل عالية الترتيب مثل G-quadruplexes. للتغلب على هذه العقبة ، استخدمنا نهج "pop-in / pop-out" مشابهًا لتلك المستخدمة في تحرير جينوم الخميرة ، بما في ذلك علامة لإثراء الحيوانات المستنسخة التي خضعت للموارد البشرية. أدى فحص الخلايا الفلورية (أو اختيار الخلايا المقاومة للعقاقير) إلى إثراء الحيوانات المستنسخة المرغوبة بشكل كبير في الخطوة الأولى ، حيث خضع أكثر من 80 ٪ من الحيوانات المستنسخة الإيجابية لـ GFP إلى HR. وتجدر الإشارة إلى أن التحليل الدقيق للولادة وتسلسل وعدد النسخ للجين المستهدف أمر بالغ الأهمية ، حيث وجدنا أن نسبة كبيرة من الحيوانات المستنسخة لديها واحد تيرت احتوى الأليل الذي تم تعديله بواسطة HR على indels الصغيرة في الأليل الآخر ، والذي يُفترض أنه تم قطعه أيضًا بواسطة Cas9 ولكن تم إصلاحه بعد ذلك من خلال NHEJ. لاحظنا أيضًا أن بعض الحيوانات المستنسخة فقدت نسخة من تيرت بعد التحرير ، على الأرجح بسبب موقع التيلومير القريب من تيرت مسبباً خسارة جزئية للكروموسوم بعد تحريض انكسار الشريطة المزدوجة.

أظهرت التجارب الموازية باستخدام بلازميد دائري أو بلازميد خطي مثل DT أن كفاءة تكاملها من خلال الموارد البشرية متشابهة (دائري ، 1.0 ٪ خطي ، 1.2 ٪ جدول S2 في ملف إضافي 1). ومع ذلك ، يتم دمج البلازميد الخطي بشكل متكرر في المواقع غير المستهدفة في الجينوم. لذلك اخترنا DT الدائري لأن نسبة تكامل DT المحدد إلى غير المحدد في النسخ الإيجابية لـ GFP كانت أعلى.

أثناء خطوة "pop-out" ، تمت إزالة كاسيت تعبير العلامة من خلال إعادة التركيب بوساطة Cre ، في حالة إدخال علامة FLAG-SNAP. ظل موقع LoxP بين تسلسل ترميز FLAG و SNAP ، لكنه لم يتداخل مع وظيفة أي من العلامتين. لإنشاء تعديلات زوج أساسي واحد ، كان من الضروري إجراء جولة ثانية من التحرير بوساطة CRISPR-Cas9. تم استخدام فقدان علامة التألق لإثراء الحيوانات المستنسخة التي قضت على شريط التعبير eGFP ، واحتوت 1.5 ٪ من الحيوانات المستنسخة المحددة على تغيير التسلسل المطلوب. يمكن تحسين تواتر وخصوصية نهجنا بشكل أكبر باستخدام الطرق الموصوفة سابقًا مثل استخدام نيكاز D10A Cas9 ، أو تثبيط مسار NHEJ وراثيًا أو كيميائيًا ، أو مزامنة دورة الخلية [27-30].

كانت الملاحظة غير المتوقعة هي أن إدخال تسلسل علامة FLAG-SNAP زاد من التعبير عن تيرت الجين. كما ذكر أعلاه، تيرت له سياق تسلسل محدد للغاية حول منطقة 5 ، والتي يُفترض أنها مسؤولة عن نشاط النسخ المنخفض. قد يؤدي إدخال تسلسل FLAG-LoxP-SNAP إلى مقاطعة هذه الحالة بطريقة ما وتحسين مستوى النسخ. بشكل عام ، قد يكون وضع علامات C-terminal أقل عرضة لتغيير مستوى النسخ. ومع ذلك ، فإن وضع العلامات الطرفية C لـ TERT يضعف وظيفته داخل الخلايا [12] وبالتالي لم يكن خيارًا لدراساتنا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تعمل علامة SNAP كعلامة قابلية للذوبان ، مما يؤدي إلى استقرار بروتين TERT. في المستقبل ، يمكن اختبار علامات مختلفة لتحديد العلامات التي لها تأثير ضئيل على تعبير TERT. الأهم من ذلك ، أن الكمية الإجمالية لأنزيم الإنزيم تيلوميراز المُجمَّع تمت زيادتها أقل من خمسة أضعاف بناءً على قياسات نشاط التيلوميراز لدينا. لذلك ، يجب أن يكون لتعديل TERT باستخدام علامة FLAG-SNAP تأثيرات قليلة فقط في بيولوجيا التيلوميراز.

توزع التيلوميراز بشكل غير متساو بين التيلوميرات في المرحلة S.

باستخدام استنساخ FLAG-SNAP-TERT ، قمنا بتحليل التوطين الخلوي لبروتين TERT المنتج داخليًا. كما هو متوقع ، تم ترجمة TERT إلى أجسام Cajal والتيلوميرات. كشفت الدراسات السابقة التي استخدمت الأجسام المضادة لـ TERT أيضًا عن بؤر مرتبطة غير مرتبطة بالتيلوميرات [21] وإشارات مرتبطة بالنوى [17 ، 21 ، 22] ، والتي لم تُشاهد في تجاربنا وقد تعكس نقصًا في خصوصية اكتشاف IF لـ TERT. على النقيض من التيلوميراز المفرط التعبير ، والذي يتمركز في جميع التيلوميرات المكتشفة في المرحلة S [19] ، فإن TERT المنتج داخليًا كان قابلاً للاكتشاف فقط عند 5-7٪ من بؤر TRF2 في المرحلة S ، والتي يمكن أن تمثل مجموعات من التيلوميرات المتعددة التي توظف التيلوميراز. تشير هذه الملاحظة إلى أن التيلوميراز الداخلي لا يطول إلا عددًا محدودًا من التيلوميرات في أي نقطة زمنية معينة. اقترحت الدراسات السابقة أن جميع التيلوميرات الموجودة في الخلايا السرطانية البشرية ممدودة في كل دورة خلوية [31] ، الأمر الذي يتطلب تجنيد التيلوميراز في كل تيلومير. في الخميرة الناشئة ، لا يمد الإنزيم تيلوميراز جميع التيلوميرات في أي دورة خلوية معينة ، بل يمتد فقط أقصر التيلوميرات [32] بما يتفق مع هذا الاكتشاف ، فقط مجموعة فرعية من التيلوميرات تتضامن مع الخميرة TR خلال المرحلة S [33]. تتوافق بياناتنا في الخلايا البشرية مع تجنيد التيلوميراز في مجموعة فرعية من التيلوميرات في أي نقطة زمنية معينة في المرحلة S ، لكن لا يمكننا استبعاد أن عددًا صغيرًا أو إنزيمًا واحدًا من الإنزيم تيلوميراز يتم توطينه في كل تيلومير ، لأن طريقتنا ليست حساسة يكفي للكشف عن جزيئات مفردة.

إذا تم تجنيد التيلوميراز لعدد صغير فقط من التيلوميرات في أي نقطة زمنية معينة ، فيجب أن يحدث استطالة التيلومير المتسلسلة لإضافة تكرارات تيلوميرات إلى العديد أو كل التيلوميرات في دورة خلية واحدة. تتوافق بياناتنا مع النموذج الذي تقوم فيه التيلوميرات بتجنيد الإنزيم تيلوميراز بالتتابع ، والذي يحتمل أن يتحكم فيه توقيت تكرار التيلوميرات الفردية ، والذي يختلف اختلافًا كبيرًا بين الكروموسومات [34]. بالاتفاق مع هذه الفكرة ، يكون توطين TERT على التيلوميرات هو الحد الأقصى في منتصف المرحلة S. الأهم من ذلك ، أن تجنيد التيلوميراز في التيلوميرات لا يجب بالضرورة أن يؤدي إلى استطالة التيلومير. قد يتم تجنيد التيلوميراز لكل تيلومير في مرحلة S واحدة ولكن فقط يطيل مجموعة فرعية منها. اقترحت العديد من الدراسات أن أقصر التيلوميرات يتم استطالة بشكل تفضيلي في الخلايا البشرية [35 ، 36] ، ولكن في هذه الحالات تم الإفراط في التعبير عن الإنزيم تيلوميراز ، والذي ثبت أنه يحرر تجنيد التيلوميراز في التيلوميرات [19]. بدلاً من ذلك ، تتوافق بياناتنا أيضًا مع مجموعة فرعية فقط من التيلوميرات التي يتم استطالةها في دورة خلية واحدة. لتمييز هذه النماذج ، سيكون من الضروري إجراء الفحص المجهري الفاصل الزمني لتجنيد التيلوميراز في التيلوميرات طوال المرحلة S.

التراجع عن مرض السرطان المرتبط تيرت أدت طفرة المروج إلى خفض مستويات التيلوميراز والحد من معدل نمو الخلايا السرطانية

حددت الدراسات الحديثة للعديد من جينومات السرطان البشري نوعين متكررين للغاية تيرت طفرات المروج (سي - 124 ت و سي - 146 ت) [8 ، 9 ، 37-39] ، والتي تنشئ مواقع ربط جديدة لعامل نسخ ETS GABP [40]. المقايسات الجينية لمراسل Luciferase التي تقارن WT / متحولة تيرت اقترحت متواليات المحفز أن المحفزات مع أي من الطفرتين تقود مستويات أعلى من التعبير الجيني (زيادة مضاعفة تقريبًا مقارنة بـ WT) [8]. أظهر التحليل الكمي لمستويات تعبير TERT الذاتية ونشاط التيلوميراز الخلوي وأطوال التيلومير في خطوط الخلايا السرطانية مع أو بدون هذه الطفرات أن هذه الطفرات مرتبطة بمستويات أعلى من التيلوميراز وأطوال تيلومير أطول [10]. لاختبار العلاقة السببية بين الطفرات ومستويات التيلوميراز الذاتية ، قمنا بتحرير الذاتية تيرت المروج ، مما يسمح لنا بإجراء مقارنات بين خطوط الخلايا متساوية المنشأ. التراجع عن ملف سي - 124 ت طفرة في خط خلية سرطان الظهارة البولية ، والتي حملت في الأصل أليل WT وواحد سي - 124 ت أليل متحولة ، أدى إلى انخفاض مستويات التيلوميراز ، وتقصير التيلومير وتقليل معدل تكاثر هذه الخلايا.

أحد التحذيرات في بروتوكول تحرير الجينوم الخاص بنا هو أن مستوى التعبير عن TERT يؤثر على نمو الخلايا. كلتا الخطوتين (إدخال شريط eGFP في المروج وإدخال C في الموضع −124 بدلاً من T) من شأنه أن يقلل من مستوى تعبير TERT ويجعل النسخ المرغوبة في وضع غير مؤات انتقائي. سيؤدي هذا إلى تقليل معدل نجاح الحصول على نسخة مرغوبة بشكل كبير ، كما أدى إلى القلق من أن الحيوانات المستنسخة الثلاثة التي حصلنا عليها من SCaBER ربما تكون قد جمعت طفرات أخرى تتصدى لتأثيرات فقد سي - 124 ت طفرة وزيادة مستويات التيلوميراز. يثير هذا سؤالًا عامًا حول كيفية استهداف الجينات التي تؤثر على نمو الخلايا. يتمثل أحد الحلول المحتملة في توفير نسخة وظيفية من الجين أثناء عملية التحرير وإزالتها بعد ذلك. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أي تأثيرات محتملة خارج الهدف لتعديل الجينوم يمكن أن تؤثر أيضًا على الأنماط الظاهرية للنسخ. للمساعدة في التحكم في التأثيرات غير المستهدفة ، يمكن للمرء تقديم تسلسل WT و mutant المروج لاستبدال كاسيت التعبير eGFP المدمج في الخطوة الأولى من تحرير الجينوم. بسبب هذه المخاوف المحتملة ، ندرك أن الأنماط الظاهرية التي لاحظناها قد تعكس أكثر من مجرد فقدان تيرت طفرة المروج.

ومن المثير للاهتمام أن تقديم سي - 146 ت الطفرة في خلايا HEK 293T ، التي حملت في الأصل أليلين WT ، لم تكن كافية لزيادة مستوى التيلوميراز. في تحرير جينوم الخلية HEK 293T الخاص بنا ، تم دمج إدخال صغير من اثنين من السيتيدات في الأليل الذي خضع لـ NHEJ ، ومن الممكن أن يؤدي هذا الإدراج إلى تقليل نسخ تيرت، مما أدى إلى تحييد تأثير تنشيط سي - 146 ت طفرة على الأليل الذي خضع للموارد البشرية. ومع ذلك ، فإن حقيقة أن النسخ التي تحتوي على أليل إدخال CC واحد وأليل eGFP واحد لإدخال كاسيت

اقترح 40 ٪ من مستوى التيلوميراز مقارنة بالخلايا الأبوية أن إدخال CC لا يؤثر بشكل كبير على تعبير TERT (الشكل S6 في ملف إضافي 1). الاحتمال الآخر هو أن سي - 124 ت طفرة و سي - 146 ت وظيفة الطفرة بشكل مختلف. لكن التفسير الأكثر ترجيحًا هو أنه نظرًا لأن خلايا HEK 293T قد نشطت بالفعل تعبير TERT من خلال آلية بديلة ، فإن خطوة تحديد المعدل التي يمكن تسهيلها بواسطة طفرة المروج قد تم التغلب عليها بالفعل بوسائل أخرى. مهما كانت الآلية ، فإن هذه النتائج تسلط الضوء على أهمية الخلفية الجينية في التحقيق الوظيفي للطفرات المرتبطة بالأمراض.


1. الطريقة المؤتمتة لعزل الحمض النووي

توفر تجسيدات معينة للكشف الحالي طرقًا ، خاصة الطرق الآلية ، وأجهزة لعزل الأحماض النووية من العينات الميكروبية المختلطة. يمكن تحليل العينات الميكروبية ، مثل الخلايا البكتيرية ، للحصول على شكل نقي (أي محللة بكتيرية أو خلوية تم تطهيرها). في بعض النماذج ، تشتمل الطريقة على خطوات التخلص من مجموعة العينات في مجموعة من حاويات العينات (على سبيل المثال ، تحتوي كل منها على مجموعة من الخرزات) وتطبيق القوة على حاويات العينة ، حيث تشتمل كل حاوية عينة على العينة وحبة من أجل تعطيل الخلايا الميكروبية أو الأبواغ أو أنواع الخلايا الأخرى (مثل البكتيريا والفطريات والجراثيم والأوليات) والفيروسات ، مما يوفر إطلاقًا غير متحيز للأحماض النووية الميكروبية. قد تشتمل الطريقة على الحصول على عينات من كائن أو أكثر ، وملامسة العينة بمجموعة من الخرزات ومخزن تحلل ، وتطبيق قوة مطلقة لتحليل العينة وإطلاق الأحماض النووية (على سبيل المثال ، DNA و / أو RNA). علاوة على ذلك ، يمكن فصل المادة الطافية المشتملة على الأحماض النووية عن مجموعة الحبيبات ثم يتم تنقية الأحماض النووية من المادة الطافية باستخدام الطرق المعروفة في الفن.

في بعض النماذج ، تشتمل الطريقة على إضافة مجموعة من العينات في مجموعة من حاويات العينات وتطبيق قوة ميكانيكية على حاوية العينة. قد تشتمل حاويات العينة على العينة ، وشريط مغناطيسي تقريبي ، وحبة أو مجموعة من الخرزات لتعطيل العينة ، مثل الخلايا الميكروبية والفيروسات. وفقًا لذلك ، يمكن أن توفر الطرق الحالية إطلاقًا غير متحيز للأحماض النووية الميكروبية.

في جوانب معينة ، قد يشتمل الجهاز الخاص بتطبيق قوة ميكانيكية آلية على الشريط المغناطيسي المتقلب ، وبالتالي على الحبيبات ، على مصدر مجال مغناطيسي دوار أسفل حاوية العينة ولوحة محرك متذبذبة تتأرجح حاوية العينة في أفقي طائرة. وفقًا لذلك ، تم توفير أيضًا هنا عبارة عن جهاز يشتمل على مصدر مجال مغناطيسي قيادة يتم وضعه أسفل حاوية العينة. يمكن وضع حاوية العينة على لوحة القيادة الميكانيكية القادرة على التذبذب الجانبي أو المداري فيما يتعلق بمصدر المجال المغناطيسي. قد يتكون مصدر المجال المغناطيسي من مغناطيس دوار حول محور عمودي ، حيث تكون قطبية المغناطيس طبيعية بالنسبة لمحور دوران المغناطيس.

يمكن محاذاة المواضع المركزية للوحة القيادة ومجموعة حاوية العينة مع محاور الدوران لمغناطيس القيادة. قد تكون سرعة تذبذب لوحة القيادة في نطاق مقدار حجم المقطع العرضي لحاوية العينة الفردية خلال 1 إلى 30 ثانية. قد يكون إزاحة لوحة القيادة في حدود 0.5 إلى 2.5 من حجم المقطع العرضي لحاوية العينة الفردية.

يمكن ضبط القوة الميكانيكية بواسطة وحدة التحكم. قد تكون القوة الميكانيكية وتوزيعها عبر مجموعة حاويات العينات دالة لسرعة دوران المغناطيس والإزاحة الخطية ومعدلها في لوحة القيادة. يمكن إنتاج القوة الميكانيكية المطبقة على تعدد القضبان المغناطيسية المتضاربة عن طريق التفاعل بين الأقطاب المغناطيسية لشريط مغناطيسي تقريع والأقطاب المغناطيسية لمغناطيس الغزل أسفل حاوية العينة. يمكن أن يؤدي التحريك والانزلاق لشريط مغناطيسي تقريع إلى تحويل الطاقة الميكانيكية المطبقة إلى حركة تقريع ميكانيكية داخل كل حاوية عينة.

يمكن تحقيق التقليب الميكانيكي للخرز داخل حاوية العينة بطرق متعددة. في إحدى الطرق ، قد يوفر مصدر مجال مغناطيسي دوار خارجي تذبذبًا جانبيًا أو مداريًا لشريط مغناطيسي تقريع في كل حاوية عينة. في طريقة أخرى ، يمكن تطبيق التذبذب الميكانيكي الخارجي على حاوية العينة. قد يكون التذبذب الميكانيكي هو التذبذب الجانبي أو التذبذب الرأسي أو التذبذب المداري أو مزيج منهما. يمكن تنفيذ هذه الطريقة بدون شريط مغناطيسي تقريع. قد يشتمل جهاز تطبيق القوة الميكانيكية على حاوية العينة أو مجموعة قضبان التحريك على شاكر. في طريقة بديلة ، يمكن تطبيق التذبذب الخارجي على مجموعة قضبان التحريك التي تتكون من مجموعة من مجسات التقريب المقدمة في مصفوفة مقابلة من حاوية العينة. يمكن أيضًا تنفيذ هذه الطريقة بدون شريط مغناطيسي تقريع. قد يشتمل جهاز تطبيق القوة الميكانيكية على حاوية العينة أو مجموعة قضبان التحريك على شاكر. على سبيل المثال ، قد يكون شاكر ، على سبيل المثال لا الحصر ، شاكر صفيحة ميكروسكوبية Teleshake 1536-6 (Veriomag).

قد يكون الجهاز مصنوعًا من مواد غير مغناطيسية ، مثل الألومنيوم غير الممغنط أو الفولاذ المقاوم للصدأ أو Delrin أو Mu-metal. قد يحتوي الجهاز على سطح صلب مؤكسد. قد تكون البراغي من الفولاذ المقاوم للصدأ غير الممغنط ويمكن وضع خزانة ملولبة ، مثل Loctite ، على البراغي. قد يكون لمغناطيس محرك الأقراص أبعاد حوالي 0.1-10 بوصة ، مثل 1 أو 2 أو 3 أو 4 أو 5 أو 6 أو 7 أو 8 أو 9 بوصات ، خاصة بحجم 2 بوصة × 2 بوصة × 2 بوصة. بدلاً من ذلك ، يمكن استخدام مغناطيسات متعددة بحجم أصغر ، مثل 2 بوصة × 2 بوصة × 0.5 بوصة. قد تكون سرعة دوران المغناطيس حوالي 1000-10000 دورة في الدقيقة ، مثل 2000 أو 3000 أو 4000 أو 5000 أو 6000 أو 7000 أو 8000 أو 9000 دورة في الدقيقة. قد يكون حامل اللوحة متوافقًا مع اللوحات القياسية ، مثل لوحة 96 بئر أو 48 بئر أو 24 بئر. قد يكون للحركة الجانبية لحامل اللوحة إزاحة حوالي 5-50 مم ، مثل حوالي +/ 10-20 ، 15-25 ، 20-30 ، أو 25-35 مم. قد يكون معدل الحركة الجانبية حوالي 0.1-10 تكرار في الدقيقة ، مثل 0.5-2 تكرار في الدقيقة.

في بعض الجوانب ، قد يحتوي الجهاز على أدوات تحكم يدوية ، مثل محرك محرك مغناطيسي مع منظم rpm و / أو محرك حامل لوحة عيار مع منظم rpm. قد يحتوي الجهاز على مصباح مؤشر جاهز أو قيد التشغيل. يمكن أن يحتوي الجهاز على عملية أو أوامر مؤتمتة واحدة أو أكثر مثل ، على سبيل المثال لا الحصر ، بدء واجهة مشغل دورة انتشار العينة ، وبدء توزيع المخزن المؤقت ، وبدء توزيع العينة ، وإكمال دورة انتشار العينة ، وجاهز لإزالة لوحة العيار ، وبدء تقريع العينة ، اكتمال تقريع العينة ، و / أو بدء معالجة العينة.

مزيد من المتوفر هنا عبارة عن مجموعة تشتمل على مجموعة من الحبيبات عالية الكثافة ، وشريط مغناطيسي تقريع ، وجهاز لتطبيق قوة ميكانيكية آلية عبر مصدر مجال مغناطيسي دوار لشريط مغناطيسي تقريع ، وعينات تحكم. في بعض الجوانب ، تشتمل العينة الضابطة على مجتمع ميكروبي مختلط له نسبة معروفة من كل مكون ميكروبي.

في بعض النماذج ، قد يستخدم البروتوكول الآلي محطات عمل مثل خط Microlab STAR ™ أو محطة العمل الآلية Biomek 4000 لتطبيق القوة على العينات التي تشتمل على خرزات. قد تشتمل مكونات محطات العمل على كتلة بئر عميق ، وشاكر (على سبيل المثال ، Hamilton® Heater Shaker) ، وعينة الخالط أو جهاز ضرب الخرزة (على سبيل المثال ، المجانس عينة MP Biomedicals Fastprep). مزيد من أجهزة الضرب بالخرز ، والهزازات ، وخلاطات الدوامة ، وما شابه ذلك التي يمكن استخدامها مع الكشف الحالي مدرجة في الأشكال. 17A-17B. تشمل أجهزة تقريع الحبيبات النموذجية MP-Bio FastPrep-24 و MP-Bio FastPrep-96 و 2025 Geno / Grinder و 2010 Geno / Grinder و TissueLyser LT و TissueLyser II (الجدول 1). كما تم التفكير هنا أيضًا في الأجهزة التي لا تعتمد على الأنظمة الأساسية المفتوحة الحالية. على سبيل المثال ، قد يكون الجهاز عبارة عن نظام مغلق يعالج عينة إلى أحماض نووية نقية. في جوانب معينة ، لا يتطلب الجهاز سوى تحميل خرطوشة ويتم إجراء الضرب والتنقية على المنصة.

في بعض الجوانب ، يمكن أن يكون جهاز الهز أو جهاز الضرب بالخرز عبارة عن وحدة خلط / شاكر متعددة الأوعية قادرة على خلط / اهتزاز عينات مختلفة في أوعية متعددة في وقت واحد. على سبيل المثال ، يمكن أن يكون الخلاط متعدد الأوعية عبارة عن دوامة لوحية متعددة الأوعية. بشكل عام ، الهزاز عبارة عن جهاز تحريض موجه لتحريك العينة ، مثل عينة في أنبوب الطرد المركزي الصغير (على سبيل المثال ، أنبوب إيبندورف) ، أو أنبوب الطرد المركزي ، أو القارورة ، أو لوحة ميكروويل. يتم استخدام جهاز الضرب بالخرز لتحريك الحبيبات بقوة وتردد كافيين لتحفيز الخلية ، خاصةً جدران الخلايا الصلبة للكائنات الحية الصعبة. يحدث تمزق الخلية ، عندما تتجاوز الطاقة الحركية للخرز المتصادم الطاقة المرنة المخزنة في الخلية. يتطلب تحلل التصادم بين الحبيبات سرعات نسبية تبلغ 0.3 م / ث ، والتي لا يمكن تحقيقها إلا عند اهتزازات الغرفة الحجمية الكبيرة. يجب أن يكون تدفق القص بين الحبيبات لتحقيق التحلل للبكتيريا النموذجية (موجبة الجرام) في نطاق 5-10 م / ث. وبالتالي فإن الاصطدامات بين الحبيبات هي الآلية الأساسية لتمزق الخلية أثناء التحلل. في بعض الجوانب ، يمكن أن تولد الهزازات حركة مدارية للخلط ، خاصةً اهتزاز العينة السائلة. في جوانب أخرى ، تكون حركة شاكر أفقية أو رأسية. على سبيل المثال ، يمكن غمس قضيب مباشرة في الأنبوب وتحريكه. يمكن استخدام أداة تحريك مغناطيسية لتحريك شيء مسروق ، مثل كرة ، داخل أنبوب أو رف. يمكن أيضًا استخدام حركات الطحن بالإضافة إلى صوتنة وفواصل دوارة.

قد تشتمل الهزازات النموذجية على خلاط Fisher Scientific Analog Vortex Mixer مع ملحق أنبوب تقريع الخرزة ، وخلاط دوامة الصفيحة الدقيقة المتقدم ، و IKA MS3 Digital Vortex ، ووحدة Hamilton Heater Shaker. بشكل عام ، يمكن أن تكون سرعة الهزازات حوالي 300 إلى 5000 دورة في الدقيقة ، مثل 2500 دورة في الدقيقة لأطباق الميكروتر ، وتصل إلى 200 دورة في الدقيقة لألواح الآبار العميقة ، أو 1800 دورة في الدقيقة للأنابيب. قد تكون الهزازات المدارية أو أي جهاز خلط آخر أي جهاز مناسب لخلط محتويات الأنابيب ، ويفضل أن يكون قادرًا على خلط الأنابيب دون إزالتها من الغرفة ، مثل حاملات الأنابيب. على سبيل المثال ، قد تكون الهزازات المدارية عبارة عن هزازات سخان هاملتون المتوفرة من هاملتون روبوتيكس في رينو ، نيف ، ويمكن تشغيل الهزازات المدارية في درجة حرارة الغرفة (أي بدون تسخين) ، أو عند درجة حرارة محددة مسبقًا يتم التحكم فيها بواسطة عناصر التسخين المقترنة بالهزازات ( على سبيل المثال ، ملف مقاومة). يكشف طلب براءة الاختراع الأمريكية رقم US20150036450 ، المدرج هنا بالرجوع إليه ، عن آلية لتوليد حركة مدارية لهز عينة تم استيعابها بواسطة حامل العينة والتي يمكن استخدامها في الطرق الحالية. تم الكشف عن أدوات الهزاز الأخرى للاستخدام في الكشف الحالي في ، على سبيل المثال ، US2010 / 218620 ، براءة الاختراع الأمريكية. No. 4،990،130، JP 2007-237036، JP 10-277434، US Pat. رقم 6،190،032، EP 1،393797، EP 0،462،257، WO 98/32838، EP 0،679،430، US 2011/286298، US Pat. تم إدراج الأرقام 4،990،130 و 4673،297 والولايات المتحدة 2009/086573 جميعًا هنا بالرجوع إليها. في بعض الجوانب ، يكون الضرب بالخرز أو جهاز تحريك الخرزة كما هو موصوف في براءة الاختراع الأمريكية. الأرقام 7495.090 و 5702.950 و 6942806 و 7622.046 و 8430.247 بالإضافة إلى منشور البراءات الدولي رقم WO1996012959.

قد تتكون مجموعة حاويات العينات (على سبيل المثال ، مجموعة من الخرزات) داخل غرفة. يمكن أن تكون الحجرة عبارة عن حاوية لأي مادة وحجم وشكل مناسب. في نماذج معينة ، تكون الحجرة عبارة عن وعاء بلاستيكي. قد تكون الحجرة ، على سبيل المثال ، على شكل أنبوب طرد مركزي دقيق (على سبيل المثال ، أنبوب إيبندورف) ، أنبوب طرد مركزي ، قارورة ، لوحة ميكروويل. يمكن للغرفة تحديد مقصورة / حجرة واحدة فقط لعقد الخلايا ، والخرز ، وعنصر التحريك ، أو مجموعة من الحجرات / الغرف المنفصلة (على سبيل المثال ، مجموعة من الآبار) لعقد المخاليط (الخلايا ، والخرز ، وعناصر التحريك) في عزلة من بعضنا البعض. قد تكون الحجرة عبارة عن حاوية مغلقة أو قابلة للغلق ، مثل حاوية بغطاء أو غطاء أو غطاء. قد يكون السطح الداخلي خاملًا كيميائيًا للحفاظ على سلامة المادة التحليلية محل الاهتمام ، أو الكواشف المخزنة الضرورية لعمليات مثل التحلل أو الربط أو الغسيل أو التصفية من عينة.

في نماذج معينة ، يحتوي النظام أيضًا على رف تم تكوينه ليحمل الحجرة. يمكن تكوين الحامل لاستيعاب غرف متعددة ويمكن وضعه على سطح دعم للمعالجة المتزامنة لعينات متعددة. يمكن أيضًا استخدام الرف كحامل للغرفة لأغراض التخزين. على سبيل المثال ، يمكن وضع غرف متعددة على الرف وتخزينها في الثلاجة أو الفريزر لمزيد من التحليل. قد يتم ربط الغرفة بأداة خارجية (مثل روبوت مناولة السوائل ، جهاز ميكروفلويديك ، أداة تحليلية).

يوفر تقريع الخرز بالخرز عالي الكثافة أحماض نووية سريعة وعالية الجودة وغير متحيزة. يعد تقريع الخرزة إحدى الطرق المفضلة لتجانس العينة وطريقة تحلل الخلية التي يتم فيها تحريك العينة البيولوجية (مثل الكائن الحي والأنسجة والخلية) (مثل التحريك بقوة) بالخرز (مثل الزجاج أو مادة أخرى) لتفتيت العينة و خلايا ليز من خلال الوسائل الفيزيائية. لم يتم وصف الخرزات في السابق لمثل هذا التطبيق مثل التحلل الموحد غير المتحيز للميكروبات من أجل تحديد ملامح المجتمع بدقة. تسمح الخرزات عالية الكثافة بأوقات ضرب للخرز أقصر وتؤدي إلى إنتاجية أعلى بشكل عام من الخرزات القياسية وأقل كثافة. علاوة على ذلك ، تتيح الخرزات عالية الكثافة استخدام الوحدات ذات السرعة المنخفضة والتي تكون أكثر ملاءمة للأتمتة غير المكلفة التي يمكن الوصول إليها بشكل كبير. أدت الطبيعة الميكانيكية للتحلل عن طريق تقريع الحبيبات بالتزامن مع التحلل الكيميائي إلى تحسين الفعالية ضد الكائنات الحية التي يصعب تحللها مثل البكتيريا موجبة الجرام والعتيقات والفطريات والجراثيم ، مما يضمن الحصول على الأحماض النووية لجميع الميكروبات بوفرة مما يعكس واقع. تقوم الاختبارات الحالية بتقييم الوفرة الكلية بما في ذلك الأحياء والأموات ، ولكن تم التفكير في التمييز بين الأحياء والأموات ويمكن تحقيقه باستخدام الأساليب المعروفة في الفن. كما تم التفكير في توليفات من التحلل الميكانيكي ، والتحلل الإنزيمي ، والتحلل الكيميائي. يعني مصطلح "ليس" فيما يتعلق بالخلايا اختلال سلامة جزء على الأقل من الخلايا لتحرير مكونات داخل الخلايا ، مثل النوى والأحماض النووية والبروتينات ، من الخلايا المعطلة. يشير مصطلح "التجانس" فيما يتعلق بإعداد العينة إلى مزج (عناصر متنوعة مثل البراز والأنسجة والبلغم واللعاب) في خليط موحد. يعتبر كل من التحلل والتجانس من السمات المهمة لاستخراج وتنقية الحمض النووي من عينة مختلطة تعكس بدقة التركيب الفعلي. من أجل الوصول إلى البروتينات أو الحمض النووي داخل الخلية ، يجب أولاً تمزق جدار الخلية. تُعرف هذه العملية باسم تحلل الخلايا. توجد العديد من التقنيات التي يمكنها تحقيق ذلك بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر كيميائيا وكهربائيا وميكانيكية. يوفر التحلل الميكانيكي مزايا مختلفة مثل القدرة على تحليل العينات الصعبة وكذلك عدم إدخال المواد التي يمكن أن تؤثر على العمليات النهائية. إحدى هذه الطرق الميكانيكية هي تقريع الخرز حيث يتم إضافة خرزات إلى العينة ويتم تحفيزها ميكانيكيًا لإحداث تصادمات تلحق بالخلايا.

يحدث تمزق جدران الخلايا عند حدوث تصادمات بين الحبيبات والخلايا. نظرًا لتحفيز الخرزات ميكانيكيًا بسبب حركة خارجية ستحدث تصادمات.تأخذ هذه الاصطدامات الشكل على أنها تفاعلات ضاغطة أو قص حيث تحطم الحبيبات الخلايا ضد الخرزات الأخرى أو ضد جدار الحاوية. إذا كانت الطاقة الناتجة عن هذه الاصطدامات أكبر من الطاقة المرنة لجدران الخلايا ، فإن هذه الجدران ستتمزق. يمكن أن يلعب حجم الخرزات دورًا حيث يجب أن تكون هناك حبة كبيرة بما يكفي لإحداث تصادمات ولكنها صغيرة بما يكفي بحيث لا يتم دفع الخلايا جانبًا عندما تكون في مسار الخرزات. عندما يتقلص حجم الأشياء ، تزداد لزوجتها الفعالة. يمكن أن يتسبب هذا في دفع الخلايا جانباً بدلاً من سحقها بنفس الطريقة التي تفلت بها الورقة العائمة في الماء من براثن يدك وأنت تحرك يدك عبر الماء محاولاً الإمساك بها. الجسم الأكبر والأثقل سوف يعاني من القصور الذاتي وسوف يتم دفع الماء فوقه ببساطة. ولكن في حالة وجود الأجسام الصغيرة ، لا يوجد خمول فعلي والمياه التي يتم دفعها تأخذ الورقة معها. عندما يصبح الكائن أصغر وأصغر (مثل الليسترية المستوحدة وهو 0.4-2 ميكرومتر أو خميرة الخميرة 5-10 م) تبدأ القوى اللزجة في أن تصبح مهيمنة. يمكن إظهار ذلك برقم رينولدز أصغر من 1 (بورسيل وآخرون ، 1977). عندما يحدث هذا ، لم يعد السائل يمر فوق جسم ما ولكنه يلتصق به بشكل فعال. يمكن استخدام حل باستخدام خرزات متعددة القطر لحل هذه المشكلة بالإضافة إلى تعويض الكائنات الحية والعينات ذات الأحجام المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن القوة المطلقة الناتجة عن الخرزات ربما تساهم في تمزق جدران الخلايا.

يمكن أن يكون للحركة المطبقة على الخرزات تأثير على فعالية lysing. قد لا تكون بعض الحركات الدورية فعالة لأن الخرزات ستقع في نمط منظم لن يتسبب في حدوث العديد من الاصطدامات. مثال على ذلك هو عندما يتم غزل الخرزات في دائرة ، فإن الخرزات ستتحرك جميعها بنفس السرعة ونفس المسار داخل الحاوية الخاصة بهم. لمكافحة هذا المزيد من الفوضى يجب أن يضاف إلى حركة الخرزة. يمكن إضافة ذلك عن طريق التحرك في حركة تبدو عشوائية مثل جعل العينات معلقة على الزنبركات تتحرك في حركة غير متناسقة. بدلاً من ذلك ، من خلال التغيير الحاد في اتجاه الحركة يمكن أن يتسبب في اصطدام الخرزات بالخرز القادم أو جدار الوعاء. مثال على هذه الحركة هو رفع الخرزات ثم خفضها بسرعة كبيرة. يجب مراعاة حجم الضربة بعناية لأنه إذا كان قصيرًا جدًا وقد لا تكون هناك مسافة كافية لتسريع الخرزات أثناء فترة طويلة جدًا ، فقد يتسبب ذلك في تباطؤ الخرزات عند تبديل الاتجاهات.

قد يتم صنع العديد من الخرزات من البلاستيك والزجاج والسيراميك والمعادن والمعدن و / أو أي مواد أخرى مناسبة. في نماذج معينة ، يمكن أن تكون الحبيبات مصنوعة من مواد غير مغناطيسية. في تجسيدات معينة ، تكون الخرزات متناظرة دورانيًا حول محور واحد على الأقل (على سبيل المثال ، جسيمات كروية ، مستديرة ، بيضاوية ، بيضاوية الشكل ، بيضة الشكل ، وقطيرة الشكل). في نماذج أخرى ، يكون للخرز أشكال متعددة السطوح. في بعض النماذج ، تكون الخرزات عبارة عن جسيمات غير منتظمة الشكل. على سبيل المثال ، يمكن أن تكون الخرزات من الزجاج أو السيراميك أو السيليكون (على سبيل المثال ، السيليكا المدخنة أو السيليكا الحرارية أو السيليكا الغروية أو هلام السيليكا) أو المعدن أو الفولاذ أو كربيد التنجستن أو العقيق أو الرمل أو خرز الياقوت.

في بعض النماذج ، يكون للخرز متوسط ​​قطر أكبر من 1 متر (على سبيل المثال ، حوالي 2 ميكرومتر ، حوالي 5 ميكرومتر ، حوالي 10 ميكرومتر ، حوالي 20 ميكرومتر ، حوالي 50 ميكرومتر ، حوالي 100 ميكرومتر ، حوالي 200 ميكرومتر ، حوالي 500 ميكرومتر ، حوالي 1 مم ، حوالي 2 مم ، حوالي 5 مم ، حوالي 1 سم ، أكبر من 1 سم).

على وجه الخصوص ، يمكن أن تشتمل مجموعة الخرزات (على سبيل المثال ، الحبيبات الكروية) على خرزات بأحجام مختلفة ، مثل متوسط ​​قطرها بين 0.01 و 1.0 مم ، مثل خرز من 0.25 و 0.75 مم وحبيبات تتراوح بين 0.05 و 0.25 قطر مم. تسمح الخرزات ذات الأحجام المختلفة بالتحليل الفعال للعينات. على وجه الخصوص ، تشتمل الخرزات على خليط من حبيبات قطرها 0.1 مم و 0.5 مم ، مثل بنسبة 1: 1 ، 1: 2 ، 1: 3 ، 1: 4 ، 1: 5 ، 1: 6 أو 2: 1 ، 3: 1 ، 4: 1 ، 5: 1 ، 6: 1 بالحجم. يتم التفكير في الخلائط والنسب الأخرى وقد تكون مفضلة اعتمادًا على أنواع الخرز المستخدمة. على سبيل المثال ، كرة فولاذية واحدة كبيرة مختلطة مع حبات متعددة من 0.1 مم و 0.5 مم للمساعدة في تكسير المواد الكبيرة مثل الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام خرز 2.0-5.0 مم للمساعدة في تكسير الأنسجة (مثل الحشرات والنباتات والحيوانات). يمثل 2.0 مم و 0.1 مم أيضًا تجسيدًا مفضلًا لأنه مثالي لتعطيل ناقلات الأمراض المعدية الحاملة (مثل الحشرات) وربما يكون الكائن الحي الذي يأويونه صعبًا للبكتيريا أو الخميرة الموجبة للجرام. في هذا السيناريو ، قد تصل نسبة الحجم إلى 1:10 (حبات 0.1 مم وخرز 2.0 مم). تؤثر أنواع الخرز وحجم الخرز وحجم الأنبوب المملوء جميعها على حجم ونسبة الخرزات المستخدمة.

لحساب القوة النظرية القصوى للخرز ، يمكن للمرء استخدام قانون نيوتن الثاني للحركة المعطى على النحو التالي:

الكتلة M للخرز معروفة لذا يجب حل التسارع a.

يتم إعطاء التسارع كدالة لتغيير السرعة ، v ، على مدار تغير الوقت ، t:

أ = Δ   v Δ   t = v f - v i t f - t i (2)

حيث تتوافق رموز f و i مع الحالات النهائية والأولية على التوالي. سيتم ضبط الوقت الأولي على 0 بالإضافة إلى السرعة الابتدائية. يُفترض أن تكون السرعة الأولية 0 لأن الخرزات من المفترض أن تتوقف تمامًا قبل تبديل الاتجاهات.

من المفترض أن تكون آلة الضرب بالخرز دورية وموحدة. بحيث يكون طول الضربة هو ما يحدد المسافة والوقت النهائيين اللذين تقطعهما الخرزات. تحديد طول الشوط كـ S ، ثم يمكن حساب متوسط ​​السرعة واستخدامه كسرعة نهائية على النحو التالي:

يؤدي استبدال المعادلة 3 في المعادلة 2 وتعيين القيم الأولية على أنها 0 إلى:

أخيرًا ، يؤدي الجمع بين المعادلتين 1 و 4 إلى معادلات القوة:

ستكون هذه القوة هي أقصى ما يمكن نظريًا. هناك العديد من العوامل التي يمكن أن تحد من القوة مثل الاحتكاك من السائل الذي يعتمد على اللزوجة. يمكن أن تشتمل العوامل الأخرى على حركة غير منظمة والتي قد تكون مفيدة لخرز الخرز من شأنها أن تمنع الخرزات من تحقيق أقصى قوتها. إذا لم تتحرك الخرزات في خط مستقيم فإن مسافة الشوط الفعالة ستكون أصغر وكما يتضح من المعادلة 5 فإن هذا سيقلل القوة الإجمالية.

باستخدام القيم من الجدول 1 لـ MP-Bio FastPrep-96 كمثال ، يكون طول الحد 1.5 فيه 0.0381 م. يمكن حساب الوقت من ذبذبات 1500 ذبذبة في الدقيقة. ذبذبة واحدة هي ضربة في اتجاه واحد ثم تعود إلى موضعها الأصلي. يتم تحويل التذبذبات من دقيقة إلى ثانية عن طريق الضرب في 1 دقيقة / 60 ثانية مما ينتج عنه 25 ذبذبة في الثانية. ينتج عن عكس ذلك 1/25 أو 0.04 ثانية لكل ذبذبة. نظرًا لأن التذبذب هو حدتان ، فيمكن تقسيم هذا على 2 وهو 0.02 ثانية لكل ضربة. لذلك يمكن القول أن الخرزات تتحرك بمقدار 0.0381 متر في 0.02 ثانية. استخدام هذه المعلومات في المعادلة 5 ينتج عنه


F = م *0.0381/0.02 2 = م *95.25 (6)

عن طريق توصيل كتلة الحبيبات بالنيوتن سوف ينتج عنه أقصى قوة مطبقة على الخرزات في الظروف المثالية بالنيوتن.

يمكن توسيع المعادلة 5 بشكل أكبر عن طريق استبدال الحجم والكثافة للكتلة ، م. بالضغط على أن جميع الخرزات عبارة عن دوائر كاملة ، ينتج عن ذلك:

F = 3 4  π   r 3 * ρ * s t f 2 (6)

حيث r هو نصف قطر الكرة و p هي الكثافة.

فيما يلي تفصيل للكتل المختلفة للخرز والتسارع المختلفة المرتبطة بالآلات المختلفة. الجدول النهائي هو قوة الخرزات المختلفة على الأجهزة المختلفة

يتم توفير قائمة بمصفوفات ضرب الخرز النموذجية أدناه


الاستنتاجات

يحتوي بروتين S066 SXT-Exo على أنشطة نوكلياز خارجية مفردة ومزدوجة جديلة للحمض النووي ، ولكن لا توجد أنشطة نوكلياز داخلية يمكن اكتشافها أو نخز. اعتمادًا على ترتيب ثلاثي ثابت في المحلول ، فإن أنشطة نوكلياز dsDNA الخارجية لـ SXT-Exo هي الأمثل عند درجة الحموضة 8.2 في وجود 2.5 ملي مولار 2+ أيونات وتم تحسينها بشكل كبير في وجود بروتينات SSAP و Ssb. على غرار lambda-Exo ، يعمل SXT-Exo على تحطيم dsDNA الخطي بقطبية 5'- إلى 3'- ، وهضم الركائز التي تحتوي على مجموعات 5-فوسفات ذات قابلية معالجة عالية. تعمل بروتينات SXT-Exo و SXT-Bet (S065) معًا لتعزيز أحداث إعادة التركيب المتماثل في بكتريا قولونية الخلايا ، بكفاءة كانت كاليفورنيا. 50 ضعفًا أقل من lambda-Bet / Exo أو RecET في ظل الظروف التي تم اختبارها.


تكيف الجراثيم بعد اضطراب الأس الهيدروجيني القلوي في مفاعل UASB اللاهوائي واسع النطاق لمعالجة مياه الصرف الصحي لمنتجات الألبان

كان الهدف من هذه الدراسة هو فهم كيفية تكيف المجتمع الميكروبي مع التغيرات ، بما في ذلك اضطراب الأس الهيدروجيني ، الذي يحدث أثناء عمليات بدء التشغيل والتشغيل في مفاعل UASB الميثانوجني واسع النطاق المصمم لمعالجة مياه الصرف الصحي لمنتجات الألبان. تمت مراقبة أداء المفاعل ومجتمع بدائيات النواة وقدرة تحلل الدهون على مدار 9 أشهر. تمت دراسة مجتمع الميثانوجين بواسطة ماجستيرأ/مرتا تحديد عدد نسخ الجينات واختبارات نشاط الميثانوجين. تميز مجتمع بدائيات النوى المتنوع حمأة البذر كما تم تقييمها من خلال تسلسل المنطقة V4 من جين 16S rRNA. مع بدء التغذية ، سيطر على المجتمع البكتيري Firmicutes و Synergistetes و Proteobacteria phyla. بعد حدوث زيادة عرضية في درجة الحموضة أثرت على بنية المجتمع الميكروبي ، حدثت زيادة حادة في الوفرة النسبية للمطثيات وانخفاض في ماجستيرأ/مرتا لوحظ عدد نسخ الجين ونشاط الميثانوجين. بعد فترة الشفاء ، استعاد السكان الميكروبيون التنوع والنشاط الميثانوجيني. من المحتمل أن تحدث الصدمات القلوية في معالجة مياه الصرف الصحي لمنتجات الألبان بسبب استخدام الصودا الكاوية. في هذا العمل ، كانت مرونة مجتمع بدائيات النواة مفتاحًا للنجاة من التغييرات في البيئة الخارجية ودعم إنتاج الغاز الحيوي في المفاعل.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


مناقشة

مزايا نظام Flp Double Cross System

في هذه الورقة ، أصف إجراء استنساخ بسيطًا يستخدم Flp لإعادة تجميع أجزاء من الحمض النووي التي تحتوي على مواقع FRT المقلوبة في ناقل مستقبل يحتوي على أهداف FRT ذات توجه مماثل. تحيط مواقع FRT هذه بشريط يضفي لونًا على المستعمرات المتحولة ، وفي هذه الحالة الجزء المكمّل لألفا من لاكز يضفي اللون الأزرق. يتمتع النظام بالعديد من المزايا مقارنة باستراتيجيات الاستنساخ الحالية ، خاصة لاستنساخ أجزاء متعددة من PCR في نفس موقع ناقل. أولاً ، نظرًا للخصوصية العالية والمتطلبات البسيطة لـ Flp ، يكون التفاعل عالي الكفاءة. نظرًا لأن إعادة التركيب المحافظ الخاصة بالموقع مثل Flp تلتصق تساهميًا بركيزة الحمض النووي الخاصة بها عبر حمض أميني هيدروكسيل (التيروزين لأعضاء عائلة Integrase) لا يلزم وجود عامل مساعد عالي الطاقة مثل ATP. علاوة على ذلك ، ينفذ Flp تفاعلاته دون الحاجة إلى عوامل ملحقة مثل تلك التي تتطلبها تركيبة lambda (IHF المشفر بالمضيف و Xis المشفر بالتهيئة [6].

ثانيًا ، يحفز Flp الاستئصال الجزيئي أو تفاعلات الانعكاس على جزيئات الحمض النووي التي تحتوي على موقعين من FRT وكذلك التفاعلات بين الجزيئات بين الجزيئات التي تحتوي على مواقع FRT [7]. يستخدم النظام الموصوف هنا قدرة Flp لتحفيز تفاعلين بين الجزيئات (أو ربما تفاعل واحد بين الجزيئات متبوعًا بتفاعل داخل الجزيء) وبالتالي لإدخال جزء في مستقبل البلازميد. بمجرد حدوث التقاطع المزدوج ، لا يستطيع Flp إخراج الملحق من البلازميد لأن مواقع FRT في اتجاه معكوس. الميزة المفيدة لهذا النظام هي أن Flp بكفاءة سيعكس الإدخال بين مواقع FRT مما يؤدي إلى حصول المرء دائمًا على كلا الاتجاهين للإدخال. يمكن أن يكون هذا مفيدًا جدًا في فحص اعتماد a رابطة الدول المستقلة-تسلسل الفعل أو في توليد مجسات RNA بالمعنى ومضاد المعنى.

ثالثًا ، نظام Flp double Cross بسيط من حيث المفهوم والتنفيذ. يستخدم تقنية الفحص المألوفة باللونين الأزرق والأبيض لتحديد النسخ المؤتلفة المطلوبة. لذلك فهي قابلة للتكيف مع استنساخ أي شظايا في أي موقع في أي ناقل. المتطلبات الأساسية هي بناء متجه واحد يحتوي على تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لاكز(FRT) 2 كاسيت عن طريق الاستنساخ التقليدي ومصدر Flp. يمكن استخدام ناقل المستقبلات لاستنساخ العديد من الأجزاء التي تم تضخيمها باستخدام بادئات تحتوي على مواقع FRT الطرفية. على الرغم من أن Flp غير متوفر تجاريًا ولا يتم إنتاجه بكثرة في بكتريا قولونية عندما تم وضع علامة الهيستدين (A. Shaikh و P.D. Sadowski ، غير منشورة) ، مع ذلك ، يمكن إجراء كميات كبيرة لطريقة الاستنساخ الموصوفة هنا في إجراء من عمودين [16]. تم مؤخرًا وصف إجراء مكون من عمودين لتنقية بروتين Flpe المتحول له الموسومة [17].

مقارنة مع أنظمة الاستنساخ الأخرى المستندة إلى Recombinase

يتمتع نظام Flp double cross بمزايا مقارنة بأنظمة الاستنساخ المتوفرة حاليًا والتي تستخدم إعادة التركيب الخاصة بالموقع أو topoisomerase. تستخدم البوابة & # x02122 نظام استنساخ Invitrogen [10] تفاعل lambda Integrase لنقل الجين الذي يحيط به Attمواقع L من "نسخة دخول" إلى "متجه الوجهة". على الرغم من أن هذا النظام أنيق في تصميمه ، إلا أنه قد يكون من الصعب من الناحية المفاهيمية على غير الخبراء فهمه. علاوة على ذلك ، يتطلب الأمر الإنشاء المسبق لاستنساخ الإدخال من قبل المستخدم ويعتمد على توفر متجه الوجهة المناسب من البائع. نظام Flp سهل الفهم والتنفيذ ولا يتطلب سوى بناء متجه واحد للمستقبل من قبل المستخدم.

تبيع Invitrogen و Clontech أيضًا نظام استنساخ قائم على Cre (نظام الاستنساخ Echo & # x02122 ونظام Creator & # x02122 Gene Cloning and Expression ، على التوالي). كلاهما يتطلب بناء نواقل مانحة ، وشراء نواقل متقبلة واختيار جيني بسبب الانعكاس الجاهز لتفاعلات Cre. يتغلب نظام Flp المزدوج المتقاطع على مشكلة الانعكاس باستخدام موقعين FRT معكوسين. نظرًا للكفاءة العالية ، تكفي شاشة ملونة بسيطة لاكتشاف المؤتلفات المطلوبة. تقوم Invitrogen أيضًا بتسويق TOPO & # x000ae Cloning System [14] الذي يستخدم ناقلًا يحتوي على توبويزوميراز مرتبط تساهميًا لربط جزء PCR بالمتجه. على الرغم من الكفاءة العالية ، إلا أنها تعتمد على توافر المتجهات المناسبة المحتوية على الأيزوميراز من البائع.

تحسينات على النظام

في التجارب الحالية ، استخدمت مواد أولية تحتوي على التسلسل الكامل البالغ 48 نقطة أساس لموقع FRT المحاط بـ 23 نيوكليوتيد من تسلسل "المخزن المؤقت". وبالتالي فإن البادئات PCR طويلة نوعًا ما وبالتالي باهظة الثمن. من المحتمل أن يتم تقصير البادئات بشكل كبير عن طريق حذف تسلسلات المخزن المؤقت و / أو عنصر التناظر "ج". من المعروف جيدًا أن عنصر التناظر الثالث 13 نقطة أساس ('c' ، انظر الشكل & # x200B الشكل 1 أ) 1 أ) ليس ضروريًا لإعادة التركيب الفعال بواسطة Flp في الجسم الحي و في المختبر [18 ، 19]. يحتوي موقع FRT على متناظر شبه مثالي 13 نقطة أساس ، (عناصر التناظر a و b ، الشكل & # x200B الشكل 1 أ) 1 أ) والتي قد تسبب تأثيرات غير متوقعة عند استخدام المتجه. هناك حاجة لتجارب التحكم لاستبعاد مثل هذه الآثار التي قد تعزى إلى مواقع FRT. تم إجراء دراسة تفصيلية لأهمية كل موضع في عناصر التناظر لتفاعل إعادة التركيب Flp [20]. يجب أن يكون من الممكن استخدام هذه الدراسات بالإضافة إلى البنية البلورية المشتركة لـ Flp وموقع FRT [21] لتصميم مواقع FRT التي ستكون وظيفية ولكنها لا تتداخل مع الترجمة أو العمليات الأخرى. وبالمثل ، ينبغي أن يكون من الممكن تصميم موقع FRT وظيفي غير متماثل. تم مؤخرًا وصف نظام اختيار لمتغيرات Flp مع تغيير خصوصية موقع FRT [22]. يمكن أيضًا تحقيق الإدخالات الاتجاهية باستخدام مواقع FRT الموجهة مباشرة والتي تحتوي على مناطق مباعدة غير متماثلة.

على الرغم من أنني اخترت لاكز & # x003b1-نظام التكميل كمؤشر بسبب الإلمام به والراحة ، يمكن استخدام أنظمة المؤشرات الأخرى. على سبيل المثال ، قمت بتضخيم جزء PCR يحتوي على بروتين الفلورسنت الأخضر [23] مدفوعًا بـ لاك المروج وتحيط بها مواقع FRT المقلوبة. أعاد Flp دمج هذا الجزء في ناقل pBA128. تم اكتشاف المواد المؤتلفة بسهولة كمستعمرات فلورية خضراء تحت ضوء طويل الموجة فوق بنفسجية. ومع ذلك ، فإن البروتين الفلوري الأخضر المعبر عنه من لاك يبدو أن المروج سامة بالنسبة لـ بكتريا قولونية الخلايا. يتم إجراء مزيد من التجارب مع هذا النظام. في تطوير نظام الاختبار ، استخدمت على نطاق واسع لاكز(FRT) 2 كاسيت يعمل بكفاءة إلى حد ما. إنها تجربتي أن شظايا PCR المختلفة أعيد تجميعها بكفاءات مختلفة. على سبيل المثال ، لم يتم دمج جزء KCNQ1 ، وهو جزء من جزيرة CpG من الحمض النووي البشري ، بكفاءة مثل لاكز(FRT) 2 كاسيت. يجري التحقيق في أسباب التباين في كفاءة الاستنساخ.


البيولوجيا الجزيئية ، نهج المشروع s karcher (AP ، 1995)

:: TnphoA'-2 25 مقدمة إلى Auxotrophs 27 Protocol 1.4: عزل طلاء النسخ المتماثلة لـ Auxotrophs أو انتقاء الأسنان أو الفرز على لوحات EM 27 البروتوكول 1.5: تحديد العناصر المساعدة على لوحات البلياردو 31 صنع لوحات التجميع 31 البروتوكول 1.6: تحليل الإضافات باستخدام أ 33 البحث في الأدب استراتيجيات رسم الخرائط الجينية المراجع 35 س u g g e س t e d القراءة 36 34 R E C O M B I N أ NT DNA CLONING مقدمة إلى نواقل استنساخ تقنية الحمض النووي المؤتلف 49 pBR322 52 متجهًا ينتج عنه تطوير DNA أحادي السلسلة لبلازميدات pUC 56 متجهًا لاستنساخ شظايا الحمض النووي الكبيرة تقييد نوكليازات داخلية 63 النوع الأول أو النوع الأول من تقييد نوكلياز داخلية النوع الثاني أو النوع الثاني من تقييد نوكلياز نوكليازات داخلية تقييدية من الدرجة الثالثة أو الثالثة أ توقف الهضم أ تقييد الهضم Ligase 77 هلام الكهربائي 78 73 73 76 71 ix المحتويات هيكل الاغاروز 79 جيل المجال النبضي الكهربائي الكهربائي 84 84 بروميد الاثيديوم تلطيخ الحمض النووي في المواد الهلامية 85 سلامة بروميد الإيثيديوم 86 حساسية الكشف ببروميد الإيثيديوم 86 بقع الحمض النووي الأخرى 87 التحول 88 الخلفية 88 إجراءات التحول 90 استنساخ الحمض النووي المؤتلف: نظرة عامة وصف نواقل pUC 93/3-Galactosidase 93 87 92 إدراج الحمض النووي المراد استنساخه: أصل وأهمية الحمض النووي Cosmid 203 95 البديل لاستنساخ 96 الحمض النووي المؤتلف: مستوى P1 من الاحتواء الفيزيائي - المختبر الممارسات 97 بروتوكول ل أ (اختياري): تقييد هضم عينات الحمض النووي والهلام الكهربائي لعينات الحمض النووي 97 البروتوكول 2.1 ب (اختياري): تقييد إنزيم هضم الحمض النووي ليتم استنساخه 98 البروتوكول 2.2 (اختياري): الرحلان الكهربائي للهلام 99 البروتوكول 2.3: عزل البلازميد على نطاق واسع باستخدام التحلل القلوي 102 تحديد تركيز الحمض النووي 109 البروتوكول 2.4: استنساخ الحمض النووي المؤتلف 110 الجدول الزمني لتجربة استنساخ الحمض النووي المؤتلف 110 عمليات الهضم المقيدة للاستنساخ 111 التحول البكتيري 114 البروتوكول 2.5 أ: خلايا الإشريكية القولونية المختصة 116 تحضير الخلايا المختصة وتجميدها 116 بروتوكول 2.5 ب: التحضير خلايا ملف Escherichia جديدة مؤهلة للتحول 117118 Protocol 2.5c: أ بروتوكول إجراء التحول السريع للمستعمرة 2.6 أ: عزل عزل الإعداد المصغر لبروتوكول DNA البلازميد 2.6 ب: إجراء التحضير الصغير القلوي لعزل DNA البلازميد 121 المراجع 123 القراءة المقترحة 131 استخدام الخلايا المختصة للتحول 119120266 مسرد المصطلحات أو البكتيريا موجبة الجرام الاحتفاظ باللون البنفسجي الكريستالي البكتيريا سالبة الجرام وليس GUS floGlucuronidase ، وهو إنزيم يستخدم غالبًا أ مراسل جين هيليوم بندقية جهاز يستخدم لإدخال الحمض النووي فيه أ خلية في أ مسدس الهيليوم ، غاز الهليوم تحت الضغط يستخدم لدفع الكرات المغلفة بالحمض النووي نحو النسيج المستهدف رسم خرائط مضاعف مضاعف تحديد المناطق التي لا يتطابق فيها جزيئان من الحمض النووي يتم تغيير طبيعةهما ، وخلطهما ، والسماح لهما بإعادة إنعاش بعض الجزيئات المزدوجة المعاد إحيائها. خيط واحد من كل نوع من أنواع الحمض النووي ويسمى مضاعفات مضاعفة غير متجانسة عند فحصها بالمجهر الإلكتروني ، فإن المناطق التي ليست زوجًا قاعديًا لأنها ليست متماثلة ستكون مرئية على شكل حلقات مفردة الجديلة عالية التردد لإعادة التركيب (HFR] سلالة أ ذكر بكتيريا E coli التي تحتوي على عامل F مدمج في الكروموسوم البكتيري عندما يبدأ عامل F في الاقتران مع خلية E coli (أنثى) ، يتم نقل الجينات البكتيرية على جانب واحد من موقع تكامل عامل F إلى F- خلية تهجين عالية التردد تشكيل أ جزيء الحمض النووي مزدوج السلسلة من جزيئات الحمض النووي أحادية السلسلة التي لها تسلسلات أساسية تكميلية رابطة الهيدروجين أ ضعف الرابطة الكيميائية التي تنطوي على أ ذرة الهيدروجين مهمة في تكوين الاقتران الأساسي للحمض النووي مزدوج الشريطة Intracistronic Complementation قدرة طفرتين في نفس الجين (الجين) لتكملة بعضهما البعض واستعادة الوظيفة (xComplementation of the lacZ gene هو مثال In Vitro From Latin ، بمعنى " في الزجاج "في أ أنبوب اختبار ، ليس في أ الكائن الحي في الجسم الحي يحدث في الداخل أ يتم تعريف القوة الأيونية على أنها 1/2

هو مجموع منتجات التركيز ج

ومربع الشحنة z

من كل أيون في أ الحل هو عنصر تسلسل الإدراج أبسط عنصر وراثي بدائي النواة يمكن نقله يتكون عنصر IS من متواليات الحمض النووي المتكررة النهائية والجينات المطلوبة لحركة العنصر وإدخاله في مواقع مختلفة في جينوم المضيف أزواج كيلوباز (kb) 1000 نيوكليوتيد (قاعدة) أزواج من جزء من الحمض النووي Klenow يتكون الجزء الكبير من E coli DNA polymerase I من أ سلسلة واحدة من عديد الببتيد جزيئي الوزن 76000 الناتج عن انقسام E coli DNA polymerase I بواسطة البروتياز subtilisin مسرد 267 Klett أ نوع مقياس الألوان الذي يستخدم مرشحات ملونة وتشتت الضوء لقياس كثافة أ زراعة الخلايا في "وحدات كليت". /

- إنزيم اللاكتاماز الذي ينتجه جين مقاومة الأمبيسيلين الذي يثبط نشاط البنسلين والمركبات الأخرى ذات الصلة الوثيقة مثل الأمبيسلين عن طريق شق حلقة / 3-1 اكتام من هذه المركبات lacZ Gene في lac operon من E coli الذي يشارك في استخدام اللاكتوز في أكواد lacZ من أجل إنزيم / 3-جالاكتوزيداز ، الذي يشق اللاكتوز. أ الجينات مراسل و أ علامة في نواقل استنساخ pUC طور التأخر الفترة الأولية للنمو البطيء مباشرة بعد التلقيح أ ثقافة الكائنات الحية الدقيقة في وسط النمو الصورة الكامنة تشكلت الصورة على أ مادة حساسة للضوء غير مرئية حتى يتم تطوير المادة L مرق أو LB (لوريا و Bertani)

مكتبة وسط غني لاستنبات البكتريا أ جمع الشظايا المستنسخة في أ ناقلات الاستنساخ Ligase إنزيم يستخدم ATP لتحفيز تكوين الروابط في جزيئي الاستنساخ ، يستخدم ليجاز T4 DNA للانضمام إلى جزيئات الحمض النووي المؤتلف الوصلات oligonucleotides الاصطناعية التي تُستخدم لتحويل موقع نوكلياز مقيد واحد إلى مرحلة تسجيل أخرى. مرحلة دورة نمو أ الكائنات الحية الدقيقة التي يزيد فيها النمو أضعافا مضاعفة Lysogen من اليونانية بمعنى تحفيز تحلل أ البكتيريا التي لديها أ تكامل Prophage في الحمض النووي الخاص بها في وقت لاحق ، قد يتم استئصال Prophage من الجينوم البكتيري وبدء دورة Lvsogeny أ اذكر أين أ يتم الاحتفاظ بالعاثية في أ البكتيريا مثل أ Prophage متكامل في الجينوم البكتيري Lytic Phage أ العاثية التي تحلل البكتيريا التي تصيب DNA Mainband أ متدرج كثافة متميز عن Microfufle DNA الساتلي أ أجهزة الطرد المركزي الصغيرة المكتبية (أجهزة الطرد المركزي الصغيرة) التي تُستخدم في أجهزة الطرد المركزي الصغيرة (على سبيل المثال ، 1.5 مل) أنابيب (أنابيب ميكروفوج) mRNA Messenger RNAs جزيئات الحمض النووي الريبي المنسوخة من الجينات (DNA) التي تشفر تسلسل الأحماض الأمينية في سلاسل البولي ببتيد الطفرة أ التغيير في تسلسل الحمض النووي للكائن الحي التحول الطبيعي قدرة الكائن الحي على تناول الحمض النووي الخارجي كجزء من دورة النمو الطبيعية للكائن انظر التحول الاصطناعي NBT-BCIP [Nitroblue tetrazolium (NBT) 5-bromo-4-chloro-3- فوسفات إندويل (BCIP)]

ركيزة كروموجينية لجزء من الفوسفاتيز القلوي أ نظام وسم الحمض النووي غير المشع 268 مسرد المصطلحات نيك أ الانقطاع في خيط واحد من أ الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل الناتج عن كسر أ بوند فوسفوديستر نيك للترجمة أ طريقة وسم الحمض النووي باستخدام E coli DNA polymerase I و DNase I و DNA polymerase مزدوج السلسلة يعمل على النكات الناتجة عن DNase I ، ويزيل النيوكليوتيدات على جانب واحد من النك ، بينما يملأ النيوكليوتيدات على الجانب الآخر. ثلاثي الفوسفات موجود ، سيتم دمجه في DNA بواسطة DNA polymerase I هناك أ صافي الحركة أو الترجمة

من النك من نقطة إلى أخرى على DNA مزدوج الشريطة N o r t h e r n blot نقل الحمض النووي الريبي الذي تم فصله أ هلام من الجل إلى أ الغشاء (اللطخة الشمالية) ثم يتم تهجين الغشاء مع أ مسبار الحمض النووي المسمى للكشف عن الحمض النووي الريبي المعين المتماثل مع المسبار النيوكليوزيد أ تعلق قاعدة البيورين أو بيريميدين أ بنتوز أو أ سكر ديوكسى بنتوز نوكليوتيد أ مع نيوكليوسيد أ مجموعة فوسفات أ استر الفوسفوري أ nucleoside Oligo Label أ طريقة وسم الحمض النووي الذي يستخدم الحمض النووي أحادي السلسلة ليتم تسميته ، عشوائياً ، قليل النوكليوتيدات قصيرة (6-14 نانومتر) كالبادئات ، وشظايا Klenow مثل بوليميريز الحمض النووي وتسمى أيضًا التوسيم العشوائي التمهيدي انظر جزء Klenow Oligonucleotide أ سلسلة قصيرة من النيوكليوتيدات يشير إلى عديد النوكليوتيدات أ سلسلة طويلة من النيوكليوتيدات دائرة مفتوحة تشكيل أ جزيء حمض نووي دائري مزدوج الشريطة يحتوي فيه خيط واحد من اللولب المزدوج على عامل نيك واحد على الأقل أ منطقة الحمض النووي في بداية أوبرون حيث أ يمكن أن يرتبط البروتين المثبط لمنع نسخ أوبرون أوبرون أ مجموعة من الجينات الهيكلية المتجاورة التي يتم نسخها إلى أ مرنا واحد والمناطق التنظيمية المجاورة التي تتحكم في التعبير عن الجينات. أ المقذوفات الكبيرة التي يتم دفعها نحو النسيج المستهدف بقوة مسدس البارود انظر مسدس الهيليوم pBR322 أ ناقل استنساخ البلازميد البالغ 4363 نقطة أساس تحتوي على جينات مقاومة المضادات الحيوية للأمبيسيلين والتتراسيكلين Phage Iysate العاثية النسلية التي يطلقها تحلل البكتيريا المصابة بالعاثية النمط الظاهري للكائن الحي الذي ينتج عن التعبير عن جينات ذلك الكائن الحي Plasmid An التكاثر الذاتي مسرد الجزيء خارج الكروموسومات 269 الطفرة القطبية أ الطفرة التي تؤثر على نسخ أو ترجمة جينات المصب في مشغل بولي (أ) موقع إضافة 3 'نهاية أ mRNA الذي تمت إضافة 50 إلى 250 نيوكليوتيدات أدينين عليه أثناء التعديل اللاحق للنسخ لـ mRNA Polycistronic Messenger RNA الذي يرمز لأكثر من سلسلة بولي ببتيد واحدة أو موقع استنساخ متعدد أ منطقة مواقع نوكلياز تقييدية فريدة متجمعة في أ ناقلات الاستنساخ ، مثل نواقل pUC ، تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) طريقة تضخيم الحمض النووي في المختبر PPD [4-Methoxy-4- (3-phosphatephenylspiro [1،2-dioxetane-3،2'-adamantane])] أ ركيزة كيميائية لجزء من الفوسفاتيز القلوية أ نظام وسم الحمض النووي غير الإشعاعي التمهيدي السلسلة القصيرة من النوكليوتيد الموجودة مسبقًا والمطلوبة لتخليق الحمض النووي التي تُضاف إليها نيوكليوتيدات جديدة. أزواج التمهيدي مع خيط واحد من الحمض النووي أ نهاية 3'-OH مجانية التي يبدأ منها بوليميريز الحمض النووي في تركيبها أ مسبار سلسلة الحمض النووي أ حمض نووي محدد يستخدم في التهجين لتحديد جزيئات الحمض النووي المكملة له. أ الجين الذي يتم التعرف عليه بواسطة بوليميراز RNA وبروتينات ربط الحمض النووي الأخرى وهو موقع بدء النسخ لإنتاج الحمض النووي الريبي المرسال (mRNA) المكمّل لهذا الجين Prophage أ تم دمج جينوم الملتهمة في أ الجينوم البكتيري أ سيتم تكرار النبضة التي تم الحفاظ عليها في الجينوم الفيروسي جنبًا إلى جنب مع Prototroph للجينوم البكتيري أ الكائنات الحية الدقيقة التي يمكن أن تنمو أ الحد الأدنى من المتوسط ​​(من اليونانية protos التي تعني الأول.) pUC13 أ ناقلات استنساخ تبلغ حوالي 2.7 كيلو بايت تحتوي على جين مقاومة الأمبيسيلين و أ سلسلة من مواقع نوكلياز التقييد الفريدة داخل الجزء المتبرع من جين lacZ بالرحل الكهربائي للهلام النبضي أ طريقة لفصل جزيئات الحمض النووي الكبيرة جدًا التي يتنوع فيها المجال الكهربائي (النبضي) بين أزواج مختلفة من الأقطاب الكهربائية تسمية التمهيدي العشوائي انظر الوسم Oligo Randomly Amplified DNA Polymorphic DNA (RAPD) وجدت تعدد أشكال الحمض النووي باستخدام بادئات عشوائية في أ تضخيم PCR مفيد كعلامات لرسم الخرائط الجينية إطار القراءة تسلسل الكودونات المحددة بقراءة النيوكليوتيدات ثلاثة في أ الوقت من أ بداية محددة DNA المؤتلف كودون أ يتكون جزيء الحمض النووي من الانضمام إلى نوعين مختلفين- 270 مسرد المصطلحات DNA يتم تحقيق هذا بشكل عام في المختبر عن طريق طرق استنساخ الحمض النووي المؤتلف أ الإجراء المستخدم لنقل نمط المستعمرات من أ لوحة رئيسية ل أ لوحة مختلفة أ يتم ضغط قطعة معقمة من المخمل أو ورق الترشيح برفق على سطح اللوحة الرئيسية لالتقاطها أ عدد قليل من الخلايا من كل مستعمرة للتلقيح عليها أ لوحة مختلفة في النمط الدقيق كما هو الحال في اللوحة الأصلية تقييد نوكلياز إنزيم يتعرف أ تسلسل محدد للنيوكليوتيدات ويسبب انشقاق DNA RFLP (تعدد الأشكال طول جزء تقييد). أ جزء تقييد الحمض النووي بين أفراد أ الأنواع المستخدمة أ علامة في رسم الخرائط الجينية Ribosomal ONA ترميز الحمض النووي لـ RNAs التي هي جزء من الريبوسومات Ribulose Bisphosphate Carboxylase الإنزيم الموجود في سدى البلاستيدات الخضراء الذي يحفز تثبيت ثاني أكسيد الكربون في السكريات أثناء التمثيل الضوئي يُزعم أنه البروتين الأكثر وفرة على الأرض SAM (S- AdenoxyI.L-methionine) انظر AdoMet Second-Site Suppressor أ طفرة في موقع واحد تستعيد الوظيفة المفقودة جزئيًا أو كليًا بسبب أ طفرة في أ موقع مختلف على سبيل المثال ، supE و supF هي طفرات في الجينات ترميز جزيئات الحمض النووي الريبي (tRNA) التي تتسبب في دمج الحمض الأميني في موضع أ وقف الكودون القمر الصناعي ONA في الطرد المركزي لكثافة التوازن للحمض النووي ، الحمض النووي الذي يرتبط عند أ كثافة متميزة عن تلك الخاصة بأغلبية الحمض النووي للكائن الحي قيد الدراسة. يُطلق على غالبية الحمض النووي اسم mainband DNA Sequenase ، وهو شكل هندسي من بوليميراز T7 DNA الذي يستخدم في تسلسل الحمض النووي. الكهربائي ل أ الغشاء (اللطخة الجنوبية) ثم يتم تهجين الغشاء مع أ مسبار DNA أو RNA المسمى للكشف عن DNA معين متماثل مع المسبار Southwestern Blot نقل البروتينات التي تم فصلها على أ هلام ل أ الغشاء يتم بعد ذلك فحص الغشاء باستخدام قليل النوكليوتيد المستخدم لفحص ارتباط البروتين والحمض النووي بالتنبيغ المتخصص أ العملية التي بواسطتها أ تحولات (نقل) جسيمات الملتهمة DNA فقط من أ جزء محدد من جينوم المضيف البكتيري لبكتيريا أخرى يحدث النقل المتخصص عند استئصال أ Prophage ليس دقيقًا من الحمض النووي الكروموسومي للمضيف على جانبي موقع تكامل العاثية وقد يتم نقله بواسطة الملتهمة Speed-Vac أ microfuge الذي أ يمكن إرفاق الفراغ بشكل مفيد للعينات الجافة أو لتركيزها. أ قصيرة (عادة ، 2-12 نقطة أساس) منطقة واحدة تقطعت بهم السبل في نهاية أ قطعة من الحمض النووي مزدوج الشريطة يمكن للمنطقة المفردة تقطعت بهم السبل أن ترتبط بالهيدروجين مع تسلسلها التكميلي على قطعة أخرى من الحمض النووي أحادي السلسلة انظر النهاية المتماسكة الربط اللاصق ذو النهايتين يجتمع جزيئان من الحمض النووي أو طرفي جزيء الحمض النووي نفسه معًا لأن التسلسلات التكميلية المفردة في نهاية جزيئات الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل ليجاز T4 DNA المرتبطة بالهيدروجين ثم ينضم إلى الجزيئات عن طريق تشكيل أ رابطة الفوسفوديستر عند النكات أوقف الكودونات الكودونات UAA ، UAG ، UGA ، التي لا تحدد حمض أميني وبالتالي تنتهي بترجمة سلسلة البولي ببتيد Streptavidin وهو بروتين خارج الخلية من Streptomyces avidinii يشبه إلى حد بعيد أفيدين Streptavidin أ جزيئي بوزن 60000 ويربط بإحكام البيوتين ، يحتوي Streptavidin على عدد أقل من مشاكل الارتباط الخلفية غير المحددة مما يستخدمه avidin Streptavidin أ وسيلة للكشف عن البيوتين ويستخدم في أ نوع الوسم غير المشع للأحماض النووية انظر بيوتين أفيدين Stringency كما حددها في الأصل بريتن وديفيدسون ، الصرامة هي الفرق بين درجة حرارة الانصهار ، Tm ، من أ ازدواج الحمض النووي ودرجة حرارة الحضانة ، T.

صرامة عالية أ تي

تُستخدم بالقرب من Tm Stringency بشكل أكثر شيوعًا للإشارة إلى درجة عدم التطابق التي يُسمح لها بالبقاء فيها أ النوكليوتيدات المزدوجة أ يسمح الغسيل منخفض الخشونة أ قدر كبير من عدم التطابق أ يسمح الغسل عالي الأوتار فقط لتلك التسلسلات التي تكون متقاربة تمامًا أو شبه مثالية تمامًا أن تظل كجزيئات مزدوجة ملفوفة بشكل فائق. أ حمض نووي دائري مغلق تساهميًا مزدوج العلامات مثل أن الجزيء يلتف حول نفسه القامع Oene أ الجين الذي يشفر أ المنتج الذي يتغلب على آثار أ طفرة في جين آخر Taq Polymerase أ يتم استخدام بوليميراز الحمض النووي القابل للحرارة المعزول من البكتيريا المحبة للحرارة Thermus aquaticus Taq polymerase أو غيره من بوليميراز DNA القابل للحرارة لتضخيم الحمض النووي في المختبر عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل TATA Box أ تسلسل الحمض النووي الذي يشارك في إرسال إشارة إلى بوليميريز الحمض النووي الريبي حقيقيات النوى الثاني حيث يبدأ النسخ أ الجين هو عليه أ تم العثور على تسلسل غني بـ AT محفوظ بحوالي 25 نقطة أساس قبل بدء وحدة النسخ حقيقية النواة (تسمى أيضًا أ مربع Hogness.) الحمض النووي T-DNA المنقول ، ذلك الجزء من بلازميد Ti (المحفز للورم) من الجراثيم الورمية التي تنتقل من البلازميد البكتيري وتندمج في الحمض النووي للمصنع المضيف المصاب. أ عاثية قادرة على الاندماج في الجينوم البكتيري لتتشكل أ Prophage أو إنتاج ذرية الملتهمة واستحلاب الخلية البكتيرية المضيفة 3 'نهاية أ حبلا من الحمض النووي مع أ مجموعة الهيدروكسيل الحرة المرتبطة بـ 3 'كربون من العمود الفقري الطرفي الريبوز أو الديوكسيريبوز Ti Plasmid البلازميد المحفز للورم من Agrobacterium tumefaciens ، العامل المسبب لمرض النبات "مرارة التاج". انظر درجة حرارة T-DNA Tm لذوبان نقطة المنتصف فيها أ منحنى التمسخ الحراري للحمض النووي مزدوج السلسلة درجة الحرارة التي يكون عندها نصف أزواج القاعدة من أ لا يزال جزيء الحمض النووي متزاوجًا أساسيًا ونصفه ليس مقترنًا بالقاعدة. أ يتم إنتاج منتج قابل للانتشار Transduction نقل الحمض النووي البكتيري من بكتيريا إلى أخرى عبر أ ترنسفكأيشن جسيم الملتهمة في الخلايا حقيقية النواة ، يعني هذا المصطلح امتصاص وإدماج تحول الحمض النووي الخارجي في علم الوراثة و جزيئي مادة الاحياء، هذا المصطلح يعني امتصاص وإدماج الحمض النووي الخارجي في زراعة الخلايا الحيوانية ، وهذا المصطلح يعني أيضًا التغيير في أ خط خلوي بحيث تظهر الخلايا الآن نموًا غير مقيد في الثقافة المعدلة وراثيًا التي تحتوي على DNA Transposase غريب أو خارجي إنزيم يشارك في إدخال أ ينقول إلى أ موقع الجينوم الجديد Transposon أ تسلسل الحمض النووي القادر على إدخال نفسه فيه أ موقع جديد في أ الجينوم الناتج عن عمل إنزيم ترانسبوزيز فائق السرعة أ أجهزة طرد مركزي قادرة على الوصول إلى سرعات عالية جدًا ، غالبًا ما تزيد عن 50000 دورة في الدقيقة (280000 مرة الجاذبية) في أجهزة الطرد المركزي فائقة السرعة أ يتم تشغيل الدوار في غرفة مفرغة لتقليل التسخين عن طريق احتكاك الهواء ، يشير مصطلح Unblot إلى استخدام أ الهلام المجفف المراد تهجينه أ المسبار المسمى بدلاً من نقل الحمض النووي منه أ هلام ل أ قبل التهجين مع الغشاء أ مسبار (انظر اللطخات الجنوبية والشمالية والغربية) تنفيس البوليميراز أ بوليميراز الحمض النووي القابل للحرارة المعزول من البكتيريا البدائية Thermococcus litoralis مفيد في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هذا البوليميراز DNA يقوم بأخطاء أقل مما يفعله بوليميريز Taq polymerase Virulent Phage أ العاثية التي تتطور دائمًا خلال الدورة اللايتية عندما تصيب أ اللطخة الغربية البكتيرية نقل البروتينات ، مفصولة بالهلام الكهربائي ، مسرد 273 إلى أ غشاء للكشف اللاحق عن بروتينات معينة بواسطة جسم مضاد نوع بري النوع الجيني أو النمط الظاهري للكائن الحي كما هو موجود في الطبيعة أو في مخزون المختبر القياسي للكائن الحي X-Gal 5-Bromo-4-chloro-indolyl-

-D- جالاكتوزيد ، أ الركيزة الكروموجينيك ل

- جلاكتوزيداز (منتج الجين لاكز) عند انشقاقه ، أ يتم إنتاج الراسب الأزرق X-Gluc 5-Bromo-4-chloror-3-indolyl- / 3-D-glucuronide ، أ ركيزة كروموجينية لـ / 3-glucuronidase (GUS) خميرة كروموسوم اصطناعي (YAC) أ ناقل الاستنساخ مفيد في استنساخ شظايا كبيرة جدًا من الحمض النووي على شكل حرف Z من الحمض النووي أ تشكيل الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل أ حلزون مزدوج باليد مع 12 نقطة أساس لكل منعطف من اللولب تم تسمية هذا النموذج بهذا الاسم بسبب الهيكل المتعرج لهذا اللولب انظر الأشكال A و B من DNA Zoo Blot أ لطخة جنوبية تستخدم لاختبار قدرة أ مسبار الحمض النووي من نوع واحد للتهجين مع الحمض النووي من جينومات أ عدد الأنواع الأخرى. 219-220 T-DNA ، 95 بادئة ، 221 Ti بلازميد ، 95219-220 جينات فير ، 96 ، 219-220 لطخة قلوية ، 161-162 تحلل قلوي ، عزل الحمض النووي على نطاق واسع ، 102-109 عزل DNA البلازميد المعدني الصغير القلوي ، 121-123 الفوسفاتيز القلوي ، 77 ، 141-143 ركيزة كيميائية المنشأ ، 141-143 ،

178 ركيزة كروموجينية ، 141،174 ، 176-178 أ متقبل ، 51 ، 54-55 ، 93 أ مكمل ، 51 ، 54-56 ، 59 ، 93 مانح أ ، 51 ، 54-55 ، 59 ، 93 طفرة العنبر ، 16 الأمبيسلين ، 50-53 ، 57 ، 93 ، 114-116 ، 239-242 شخصية ، 116 بنية ، 240 مقاومة للمضادات الحيوية ، 1-3242-243 مضاد حيوي ، 239-245 تصوير إشعاعي ذاتي ، 143-145 ، 188-189 ، 192 أوكسوتروف ، 15 ، 27-35 Avidin، 139 BAC (كروموسومات بكتيرية اصطناعية)، 52، 60، 63 Biotin، 136-137، 139، 140-141،170-171، 173 هيكل، 141 Biotin dATP structure، 140 Biotin labelling، DNA، 135139-140 محلول منع ، للكشف عن مسبار البيوتين ، 176 ، 181 ديكستران أزرق ، 149 ، 169 ، 171 بلوجين ، 174 عزل DNA البلازميد المصغر للغليان ، 120-121 ألبومين مصل البقر (BSA) ، 141،169 ، 172 ، 174 ، 176 ، 179- 181، 188، 211 5-bromo-4ochloro-3-indolyl phosphate (BCIP) ، 137-138 ، 141،177-178 بنية ، 141 Bromophenol blue ، 80 ، 83 ، 98-99 كلوريد الكالسيوم ، لتحويل E co / i ، 91-92 ، 114 ، 116-119 الرحلان الكهربائي الشعري ، 84-85 قمع Catabolite ، 26 عامل Chaotropic ، 146 ركيزة كيميائية المنشأ ، للفوسفاتيز القلوي ، 136 ، 140-143،178-186275276 فهرس ركيزة كروموجينيك ، للفوسفاتاز القلوي ، 136 ، 141،176-178 استنساخ الحمض النووي ، 45-47 ، 132-133 الاستنساخ ، 92 ، 110-114 ناقلات الاستنساخ ، 49 -63،251 معيارًا لـ 50 نهايات متماسكة ، 47 ، 50 ، 67 ، 78 تهجين مستعمرة ، 162-164 عمود كروماتوغرافيا ، 149 ، 170-171 إي كولاي مختص ، مجمّد ، 116-117 طازج ، 117-118 استخدام للتحول ، 118- 119 تركيز الحمض النووي ، 109-110 جين رقم النسخ ، 193-197 ، 199-200 البلازميد ، 59-60 ، 105108 DNA Cosmid ، 96 Cosmids ، 60-62 ، 95-96 CsC1 تدرج الكثافة ، 45 ، 106-108 الشكل ، 107 ج

repressor ، 15-16 ، 27 CTAB ، 141 DEAE السليلوز ، 146 محلول Denhardt ، 174-175 ، 188 ، 211 كشف ، مادة البيوتين المسمى DNA chromogenic substrate ، 176-178 ، 184 chemiluminogenic substrate ، 178-186 Dextran sulfate ، 179-180 ، 185 ، 210-211 DH5a ، 94 ، 114 أنبوب غسيل الكلى ، 167-169 Diethylpyrocarbonate (DEPC) ، 76 ، 112-113 ، 202-204 ، 207 Digoxigenin ، 138-139 ، 141،148 هيكل ، 139 Dimethylformamide (DMF) ، 114-115 ، 177-178 ، 185 ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، 91114 ، 221-222 ، 232 ديثيوثريتول (DTT) ، 77 ، 91113 دنا توتة ، مقطوعة الصفات ، 174-175 ، 179-180 ، 187 كروموسوم ، 102 ، 135 تركيز ، 109-110 بصمات الأصابع ، 225 جينوم ، 135 ، 193-195 ، 199 عزلًا عن الجل ، 145-147 ، (انظر أيضًا التلوين الكهربائي) بلازميد ، 106-107 سناب باك ، 149 قياس طيفي ، 109-110 بقعة ، 85 ، 87-88 ملفوف ، 106-107 DNase I ، 147-148 ، 150-151،169 2EM لوحة ، 27-30 E coli DNA polymerase I ، 147 ، 150-151 ، 215 شخصية ، 148 التوهج الكهربائي ، 147 ، 164-168 شخصية ، 168 تلألؤ كيميائي محسن ، 137-138 شارع الإشريكية القولونية أمطار ، 15 ، 94 DH5a ، 93-94 JM83 ، 93-94 مصدر السلالات ، 251 طفرات بروميد الإيثيديوم ، 86-87 سلامة ، 86-87 ، حساسية 101106-107 ، 87-88 تلطيخ DNA في المواد الهلامية ، 81 ، 85- 86، 101 هيكل، 86 Ficoll، 174، 179-180، 211 فورمالديهايد جل، 207-208 Formamide، 155، 174-175، 179، 208، 210-211،188 / 3-Galactosidase، 51، 54-55، 59، 93 -94 جيجر كاونتر ، 212 جل نشاف ، 137 ، 157-163 ، 199-200 ، 209-211 مشط جل ، 82 جل رحلان كهربائي ، 78-79 ، 82-84 ، 99-102 ، 131-132 جهاز ، شخصية ، 82 قطعة أثرية ، 82-84 اندماج الجينات ، شاشة الجينات الإضافية ، 161 مخزن تحميل جل ، 98-100 جدول علامات وراثية ، 94-95 لطخة جينية جنوبية ، 135 ، 193-201 خرز زجاجي ، 146 مسرد ، 261-273 غلوتارالدهيد ، 137 جلسرين ، 169 ، 232 INDEX 277 Hepes buffer، 207-208 Heteroduplexes، 1، Hfr، 43 Horseradish peroxidase، 136-138 Hybridization، 45، 135،210-213، 153-155، 174-175،179-180، 191-192 colony، 162-164 Northern لطخة ، 210-212 فرن ، 212 لطخة جنوبية ، 174-176 ، 178-180 ، 187-188 هيدروكسيباتيت ، 146 هيدروكسي كينولين ، 203 بوصة ، 4 ، حلقة التلقيح ، 12-14 تسلسل إدخال ، جدول 1-5 ، شاشات تكثيف ، 144 ، 189 شكل PCR معكوس ، 219 تكرار مقلوب ، 2-5 ، 8-9 IPTG ، 55-56 ، هيكل 247-248 ، 56 معادلات جاكوبسن ستوكماير ، 145-147 كانامايسين ، 240-243 هيكل ، 240 جزء كلينو ، 150-151 دفتر مختبر ، 9-10 تقارير معملية ، 11 قواعد معملية ، 9-10 لاسي ، 248 لاك أوبرون ، 55 ، 247-248 لاك مانع ، 247 لاكز ، 9، 51، 54-57، 59، 93-94، 247 LacZAM15، 15، 94 LamB، 26 Lambda، 15-17 att، موقع التعلق، جين 16 O، 16، 51 P gene، 16)

DNA ، 96 تم هضمه باستخدام HindIII ، لعلامات الحجم في الرحلان الكهربائي للهلام ، 101259)

Ym broth، 17 L broth، 17 Latent image، 143-144 Ligase، 46، 77-78، 113-114 Ligation، 77-78، 112-114 Linkage map، E co / i، 42 Lithium chloride، 203،205 loxP، 63 Luminol ، 137-138 هيكل ، 138 Lysis Buffer للتحلل القلوي ، 102-103 لعزل DNA البلازميد عن طريق غليان محضرات صغيرة ، 120 ليسوزيم ، 103.120 ، 163 M13 ، 54-56 Maltose ، 26-27 رسم خرائط ، 42-44 ، 134 MC buffer 25-26 fl-Mercaptoethanol، 195،204 Methylene blue، 87-88 Micropipettors، 11، 99 Minimal medium، 18-19 Mini-Preparation، DNA alkaline lysis، 121-123 الغليان، 120-121 Miracloth، 196 Mobility، 79 ، 82 جزيئي مجموعة أخبار البيولوجيا ، 250 بروتوكولًا ، 249 جزيئي معايير الوزن ، 259 مو ، 2 ، موقع استنساخ متعدد ، 55 ، 57-59 ، 93 شخصية ، 58 مسوخ ، 27 ترجمة نيك ، 139 ، 147-149 ، 151155 ، 164 ، جدول 169-170 ، 151 نتروبلو تترازوليوم (NBT) ، 137 ، 141 ، 177-178 بنية ، 142278 INDEX Nitrocellulose ، 153156 ، 160-163،184 ، 188 ، 209-211 أنظمة الكشف عن الحمض النووي غير المشعة ، 136-137 شخصية ، 137 وضع العلامات غير المشعة ، الأحماض النووية ، 136-143 لطخة شمالية ، 46 ، 202،208-213 أحماض نووية ، عزل عن المواد الهلامية ، 145-147 غشاء نايلون ، 156-159 ، 161-162 ، 184-185 نيتران ، 161 أوليجو (دي تي) سليلوز ، 206 أوليجو ، 150-152 ، 171-173 جدول ، 151 Orange G ، 149 ، 169 ، 171 ori (أصل النسخ المتماثل) ، 51 ، 53 oriT (أصل التحويل) ، 60 32p ، 136 ، 143-144 ، 147 ، 152 ، 187-188 pac ، 62 PEG (البولي إيثيلين جليكول) ، 77 ، 90 ، 103 ، 105 ممارسات معملية P1 ، 97 متجه P1 ، 62-63 تخصيب البنسلين ، 27 دائم ، 231-233 Phage)

(انظر) الملتهمة (Phage lysate ، 23-25 ​​، 26 Phage

80، 88 Phage stock، 21-23 Phage titer، 19-21 Phenol، 103-105،110، 122-123،203-204 Photobiotin، 152-153،173 structure، 152 Photobleaching، 85 Photogene، 178-185،213 mrane، 158-159، 178، 184 استخراج الحمض النووي للنبات ، 195-196 أنسجة أوراق النبات ، 190 ، 203 بلازميد ، 47 ، 49 ، 52 ، 90 ، 95 كول إي 1 ، 52 ، 60 اقتران ، 60 ، 43 نسخة رقم ، 59 فهرنهايت ، 88 تعبئة ، 53 ، 60 pBR322 ، 50-51 ، 52-53 ، 62 ، 91 رقم ، 51 pBR325 ، 53 شخصية ، 53 pUC ، 51 ، 56-62 ، 93248 شخصية ، 57 ، 58 تكرار ، 60 كفاءة طلاء ، 64 طفرة قطبية ، بولي أ موقع إضافة ، 46 بولي أ § RNA، 206-207 Poly A- RNA، 206-207 Polyacrylamide، 79، 87 Polytinker، 51، 55، 57-59، 93 شكلًا ، 58 تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، رقم 215-227 ، 216 عديد السكريات ، 196 ، 204-205 Polyvinylpyrrolidone ، 211179-180 ألواح حمام السباحة ، 15 ، 31-33 مكونًا ، 32 PPD (4-methoxy-4- (3-phosphatephenyl) spiro [1،2-dioxetane-3،2 '-adamantane] ، ركيزة كيميائية المنشأ بالنسبة للفوسفاتيز القلوي ، 137 ، 141-143 ، 178 ، 182-185 هيكل ، 143 فيلم مسبق التفليش ، 144-145 برايمر ، 57 ، 148 ، 150-152 ، 172 ، 215-223 مجسات ، 136 ، 154 ، 169 ، 174 ، 186 ترانسبوزونات بدائية النواة ، 1-6 ، 37 ، 40-41 رحلان كهربائي للهلام النبضي ، 84 حركة لجزيئات الحمض النووي الفردية ، 84 أنبوبًا للطرد المركزي فائق الختم سريعًا ، 106-107 وضع العلامات العشوائية (انظر أيضًا وضع العلامات oligo) ، 139 ، 169 ، 172 RAPDs (DNA متعدد الأشكال مضخم عشوائي) ، 226 DNA Recombinant ، 45-49 ، 77 ، 92-93 ، 110-115 ، 248 مؤتمر Asilomar ، 48 استنساخ ، 92 ، 45-134 تاريخ التطور ، 46-48 إرشادات NIH ، 49 جائزة نوبل ، 49 مستويات الاحتواء المادي ، 48 إعادة الإعمار و أو المواد الهلامية ، 196-197 ، 199 طلاء طبق الأصل ، 27-29 جين مراسل ، 8 ، 235-237 Resolvase ،

NOSX 279 الهضم المقيد ، 97-99 ، 111-114 DNA ، 97-99 ، 111-114 إعداد التفاعل ، 73-74 رد فعل التوقف ، 76-77 درجة الحرارة المثلى ، 74 تقييد نوكلياز ، 47 ، 63-77 ، 97-98 ، 134 نشاطًا متغيرًا ، جدول 74-75 ، 75 تعطيلًا للحرارة ، نشاط نجمي 68-69 ، 70 ، 74 نوع I ، 65-66 نوع II ، 66-70 تسلسل التعرف ، جدول 68-69 ، 68-69 ، 73 ، 95 النوع III ، 70 فئة أخرى ، 70-71 استخدام ، 71-77 تعيين موقع نوكلياز تقييد ، 98 ، 134 DNA ريبوسوم ، 193-194 ، 197-199 ، 200-201 ، 202 Ribosomal RNA ، 202 ريبوسوم ، 59 ، 193-194 ، 197 -198 ، 202 موقع ربط الريبوسوم ، 59 كربوكسيلاز ثنائي الفوسفات / أوكسيجيناز (RUBISCO) ، 193-194 ، 197 ، 201202 RNA ، استخراج 202-214 ، عزل 203-205،213-214 ، توصيل 213-214 ، 214 RNase ، 103-104 ، 122-123،202-204 rop gene، 60 ركيزة أمان شيمينلومينيك، 183،185 بروميد إيثيديوم، 86-87، 101،106-107، 165 فورمالدهايد، 207 ميكروويف، 99 فينول، 105، 122 نشاط إشعاعي، 188، 211-212 أنابيب نابذة فائقة السرعة، ثقب، 107 مصباح متحرك للأشعة فوق البنفسجية ، 101،165-166 لطخة ساندويتش ، 161 ساركوسي | ، 203 مستعمرة ساتلية ، 116 SDS (كبريتات دوديسيل الصوديوم) ، 98-99 ، 103 ، 121-122 ، 170-172 ، 176 ، 180-181 ، 184 ، 187-188 ، 196 ، 210-211 Sephadex G -100 ، 149 ، 170-171 التسلسل ، 133 عزل مستعمرة واحدة ، 12-13 رقم ، 13 SM عازلة ، 17 أسيتات الصوديوم وترسيب الحمض النووي ، 103 ، 121،123 ، 180 ، 173،196 وهطول الأمطار RNA ، 203،205-206 لطخة جنوبية ، 135 -2011 مثال ، 186 مثال ، جينوم ، 198 شخصية ، 156 شطيرة لطخة جنوبية ، 161 شخصية ، 161 SSC (سترات الصوديوم القياسية) ، 158-159 ، 161 ، 174-175 ، 178 ، 181 ، 187-188 ، 209-211 معقم تقنية ، 12-15 ظروف تخزين سلالات بكتيرية ، 231-232 DNA ، 233 فج ، 232-233 ستربتافيدين ، 136-137 ، 139 مصادر سلالة ، 251-252 ستربتافيدين فوسفاتيز قلوي (SAAP) ، 137 ، 159 ، 176-177 ، 181 -182،213 Streptomyces avidinii، 139 الموردون، 253-255 Svedberg unit، 193 Taq polymerase، 215،217، 222 TBE buffer، for gel electrophoresis، 99-101، 165-166 Template، for streaking Colonies، 229، 230 Tetracycline، 43، 50، 52-53،239-245 هيكل ture، 240 Tetracycline revertants، 43،243،245 N، N '، N'-Tetramethylenediamine (TEMED)، 79 T m (درجة حرارة الانصهار)، 78، 138، 152، 154-155 Toothpicking، to Pick المستعمرات الفردية، 29-31 صبغة التتبع ، للهلام الكهربائي للهلام ، 98-99 محول فج ، 88 تحويل ، 34-35 ، 44 عازلة نقل للبقع الشمالية ، 209 للبقع الجنوبية ، 158 ، 161-162 280 تحويل الفهرس ، 47 ، 88-92 ، 133-134 التحول ، E col / ، 114-120 ، 133 تحول مستعمرة سريع ، 119-120 عناصر قابلة للتحويل ، حقيقية النواة ، 8-9 ، 41-42 Transposase ، 3-5 ، Transposon ، 1-9 ، 1-44 استئصال دقيق ، جدول ، Tn3 ، 2 ، 3 ، 52 Tn3oHoHol ، Tn5 ، 2 ، 4-7 ، 15 ، 37-38 الشكل ، Tn7 ، 3 ، Tnl0 ، 2 ، 4 ، 6 ، 39-40 الشكل ، TnphoA'o2 ، 9 ، 15 ، 21 ، 24 -25 شخصية ، طفرات Transposon ، 1-44 ، 6-8 ، 25-27 مزايا ، 6-8 Tris phage buffer 17-18 ، 24 Triton X-100 ، 120 trp operon ، 88 Tween ، 20 ، 181-182 Unblot ، 155 وحدة ، 257 تشابك للأشعة فوق البنفسجية ، 157 ، 160 مطيافًا للأشعة فوق البنفسجية ، 109-110 جهاز ترانسيلومينيتور للأشعة فوق البنفسجية ، 99-101،165-166 مرق VBC ، 18-19 ، 28 غسلة لـ chemilu كشف مسبار البيوتين مينوجينيك ، 180-181 للكشف عن مسبار البيوتين الكروموجينيك ، 175-176 لطخة شمالية بعد تهجين المسبار ، 210 ، 212 لطخة جنوبية بعد تهجين المسبار ، 180-181 ، 187 Xogal ، 55-56 ، 247 هيكل ، 56 أشعة سينية ، 67 ، 80 فيلم أشعة سينية ، 144-145 ، 183 ، 189 سيانول زيلين ، 80 ، 83 ، 102 YAC (كروموسوم صناعي للخميرة) ، 52 ، 60 ، 63. Oval Road، London NW 7DX Library of Congress Cmaloging-in-Publication Data Karcher، Susan J Molecular biology: a project approach / by Susan J Karcher p cm يشمل الفهرس ISBN 0-1 2-3 9772 0-7 ... نهج المشروع هذه الصفحة تركت عن قصد فارغة البيولوجيا الجزيئية نهج المشروع سوزان جيه كارشر قسم العلوم البيولوجية جامعة بوردو ويست لافاييت. إجراء تمرين جديد في كل فترة معملية.إن هذا النهج القائم على جهاز العرض هو الذي أحمله في هذا الدليل Susan J Karcher West Lafayette، Indiana e XVll هذه الصفحة تركت فارغة عن قصد شكر وتقدير


شاهد الفيديو: Alkaline lysis method for plasmid dna isolation Hindi (يونيو 2022).


تعليقات:

  1. Trieu

    نحن نتكلم.

  2. Yozshumuro

    جميل الشكر ...

  3. Taweel

    على الألغام هو موضوع مثير جدا للاهتمام. أعط معك سنتواصل في PM.

  4. Gazilkree

    لا أستطيع المشاركة الآن في المناقشة - إنه مشغول للغاية. لكنني سأعود - سأكتب بالضرورة أفكر في هذا السؤال.

  5. Drugi

    زارت الفكرة الممتازة

  6. Arwin

    لذلك يمكنك المجادلة إلى ما لا نهاية ..



اكتب رسالة