معلومة

بروتوكول لتخفيف الحمض النووي خطوة سلم؟

بروتوكول لتخفيف الحمض النووي خطوة سلم؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أحتاج إلى تشغيل المواد الهلامية التي ليست ذات أهمية "بالغة". لذلك لا أريد أن أضيع الكثير من المال على سلم سلم. كيف أضعف سلم الحمض النووي؟ هل هناك إجراء عام ، فقد حاولت استخدام googling لواحد ، لكني أحصل على إجابات مختلفة ، مثل التخفيف بنسبة 1: 4 ، وما إلى ذلك.

هذه هي المعلومات الموجودة على سلم الخطوة ، من خلال بروميغا، يتم نشرها كصورة ، لأن النسخ واللصق سيؤديان إلى إفساد سهولة القراءة.

تعديل:

على الرغم من أنني منحت الجائزة لأنها أعطتني نفس المفهوم ؛ ما فعلته في الواقع هو افتراض أنني سأستخدم سلمًا بقيمة 60 دولارًا أمريكيًا مع صبغة بقيمة 1 دولارًا أمريكيًا.

لذلك منذ أن بدأت باستخدام صبغة تحميل بقيمة 1 مل دولار أمريكي بقيمة 6 دولارات × × ، و 100 دولارًا أمريكيًا من سلم تسلسل الحمض النووي ، و nuclease متاح مجانًا $ ce {H2O} $ ، وكنت أرغب في الحصول على نسبة 5: 1 من المحلول (صبغة و $ ce {H2O} $) إلى سلم.

سأستخدم بعد ذلك $ 12ul $ من الأسهم إلى $ 60ul $ الإجمالي.

لجعل الصبغة $ 1 $ x ، سأضيف $ 10ul $ من $ 6 $ x للصبغ لتحقيق الترابط النهائي للصبغة $ 1 $ x.

ثم سأضيف ما يصل إلى 38ul $ مع nuclease $ ce {H2O} $.

لذا ، آسف إذا تمت صياغة هذا بإفراط ، لكنه يساعدني على القراءة ، لذلك في تلخيص:

$$ + 10ul text {of 6x dye} $$ + 12ul text {of stock 100bp DNA step Ladder} $$ $$ + 38ul text {Nuclease Free} ce {H2O} $$ $$ text {__________________________________} $$

$$ sum {60ul} text {of ladder & dye} (1 text {x}) $$

منها مجموع يمكنني قسمة لرغبة قلبي.

EDIT2: تحول السلم بنجاح.


ربما يتعين عليك معايرته بنفسك. قد تكون قادرًا على تقدير ما يلي: يبلغ حد الكشف عن تلطيخ بروميد الإيثيديوم حوالي دولار واحد نانوغرام دولار لكل فرقة. يقول الملحق أنه في "1 $ mu g / mu l $" ، ولكن هذا لجميع الفرق الأربعين ومن الواضح أنها ليست كلها في نفس التركيز. اعتمادًا على العصابات التي تهتم بها (1600 وما دونها قاتمة) ، قد تتمكن من الحصول على تركيز $ ( frac {1} {25}) ^ {th} $ (1 $ mu g / 40) العصابات $ = 25 $ ng $) - لكنني سأعاير كمية صغيرة وأرى ما يصلح.


بروتوكول لتنظيف الحمض النووي وتركيزه باستخدام مجموعة Monarch & reg PCR & amp DNA Cleanup Kit (5 & mug) (NEB # T1030)

تحديث هام: بدءًا من مايو 2021 ، سنقوم تدريجياً بنقل المخزن المؤقت لتنظيف الحمض النووي Monarch إلى تنسيق مركّز يتطلب إضافة الأيزوبروبانول من قبل المستخدم. تم تحديث البروتوكول أدناه ليعكس هذا التغيير ، ولكن يرجى الرجوع إلى الإرشادات المقدمة مع منتجاتك ، حيث قد لا تتأثر حصتك.

هناك نوعان من البروتوكولات المتاحة لهذا المنتج:

    تنظيف الحمض النووي وتركيزه (أدناه): لتنقية ما يصل إلى 5 & mug من DNA (ssDNA & gt 200 nt و dsDNA & gt 50 bp) من تفاعل البوليميراز المتسلسل والتفاعلات الأنزيمية الأخرى.


معلومات الطلبية

نحن نوفر مجموعة واسعة من سلالم وعلامات Invitrogen ™ DNA لتقدير دقيق للحجم والكتلة (الكميات) لشظايا الحمض النووي. تتوفر سلالم وعلامات الحمض النووي لتحجيم الحمض النووي مزدوج الشريطة أو المفردة أو فائقة الالتفاف.

تتوفر أيضًا مجموعة متنوعة من سلالم وأقلام الحمض النووي هذه بتنسيق TrackIt ™ الجاهز للتحميل. ليست هناك حاجة لتسخين هذه العلامات أو خلطها أو تخفيفها قبل وضعها على الجل. تحتوي علامات TrackIt ™ على صبغتين للتتبع تشير إلى وقت تحقيق أقصى دقة لشظايا الحمض النووي.

موارد

تعليم الحمض النووي

تعرف على أساسيات الرحلان الكهربائي للهلام ، وسير العمل ، والاعتبارات ، والتطبيقات ، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في فصل وتحليل الأحماض النووية.


بروتوكول لمجموعة إعداد مكتبة DNA FS (E7805 ، E6177) مع مدخلات 100 نانوغرام

أدوات البداية: 100 و ndash500 نانوغرام الحمض النووي الجيني المنقى. نوصي بأن يكون الحمض النووي في 1X TE (10 مم تريس pH 8.0 ، 1 مم EDTA) ، ومع ذلك ، 10 مم تريس pH 7.5 & ndash8 ، منخفض EDTA TE أو H2O مقبولة أيضًا. إذا كان DNA المدخل أقل من 26 & microl ، أضف TE (معطى) إلى الحجم النهائي من 26 & microl.

2.1. تجزئة / نهاية الإعدادية
يحدث التجزئة أثناء خطوة الحضانة 37 درجة مئوية. استخدم الرسم البياني أدناه لتحديد وقت الحضانة المطلوب لإنشاء أحجام الأجزاء المطلوبة. قد يلزم تحسين وقت الحضانة للعينات الفردية. انظر الشكل 2.1 لنمط تجزئة نموذجي.

حجم التجزؤ
احتضان @ 37 درجة مئوية
الاقوي
100 نقطة أساس - 250 نقطة أساس
30 دقيقة
30-40 دقيقة
150 نقطة أساس - 350 نقطة أساس
20 دقيقة
20-30 دقيقة
200 نقطة أساس - 450 نقطة أساس
15 دقيقة
15-20 دقيقة
300 نقطة أساس - 700 نقطة أساس
10 دقائق
5-15 دقيقة
500 بي بي -1 كيلو بايت 5 دقائق 5-10 دقيقة

الشكل 2.1: مثال لتوزيع الحجم على محلل بيولوجي و reg. تم تجزئة الحمض النووي البشري (NA19240) لمدة 5-40 دقيقة.

2.1.1. تأكد من إذابة Ultra II FS Reaction Buffer تمامًا. إذا شوهد راسب في المخزن المؤقت ، فقم باستخدام الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لتفتيته ، وسرعان ما تمتزج الدوامة. ضعه على الثلج حتى الاستخدام.

2.1.2. دوامة Ultra II FS Enzyme Mix قبل 5-8 ثوانٍ من الاستخدام ووضعها على الجليد.

ملحوظة: من المهم عمل دوامة لمزيج الإنزيم قبل استخدامه لتحقيق الأداء الأمثل.

2.1.3. أضف المكونات التالية إلى أنبوب PCR رفيع الجدار 0.2 مل على الجليد:

مكون
الحجم لكل مكتبة
الحمض النووي 26 وماكرول
(أصفر) محلول رد فعل NEBNext Ultra II FS
7 وماكرول
(أصفر) مزيج إنزيم NEBNext Ultra II FS
2 وماكرول
الحجم الكلي
35 وماكرول

2.1.4. دوامة رد الفعل لمدة 5 ثوان وتدور لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي.

2.1.5. في Thermocycler ، مع ضبط الغطاء المسخن على 75 درجة مئوية ، قم بتشغيل البرنامج التالي:

5 & ​​ndash30 دقيقة @ 37 درجة مئوية
30 دقيقة @ 65 درجة مئوية
عقد @ 4 & درجة مئوية

إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين العينات في & ndash20 درجة مئوية ومع ذلك ، فقد طفيف في المحصول (

20٪). نوصي بالاستمرار في ربط المحول قبل التوقف.

2.2.1. أضف المكونات التالية مباشرة إلى خليط تفاعل FS:

مكون الصوت
خليط تفاعل FS (الخطوة 2.1.5.) 35 وماكرول
(باللون الأحمر) NEBNext Ultra II Ligation Master Mix *
30 وماكرول
(أحمر) محسن ربط NEBNext
1 وماكرول
(أحمر) محول NEBNext لـ Illumina **
2.5 وماكرول
الحجم الكلي 68.5 وماكرول

* امزج Ultra II Ligation Master Mix عن طريق الماصات لأعلى ولأسفل عدة مرات قبل إضافتها إلى التفاعل.

** يتم توفير محول NEBNext في NEBNext Singleplex (NEB # E7350) أو Multiplex (NEB # E7335، # E7500، # E7710، # E7730، # E7600، # E7535 و # E6609) Oligos for Illumina.

ملاحظة: يمكن خلط مزيج الربط الرئيسي ومحسن الربط في وقت مبكر وهو مستقر لمدة 8 ساعات على الأقل عند 4 درجة مئوية. لا نوصي بإضافة محول إلى مزيج مسبق في خطوة ربط المحول.

2.2.2. اضبط ماصة 100 & microl أو 200 & microl على 50 & microl ثم ماصة الحجم بالكامل لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل لخلطها جيدًا. قم بتدوير سريع لجمع كل السوائل من جوانب الأنبوب. (تحذير: المزيج الرئيسي للربط NEBNext Ultra II شديد اللزوجة. يجب توخي الحذر لضمان الخلط المناسب لتفاعل الربط ، حيث سيؤدي الخلط غير الكامل إلى تقليل كفاءة الربط. ولن يتعارض وجود كمية صغيرة من الفقاعات مع الأداء ).

2.2.3. احتضان عند 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في جهاز التدوير الحراري مع غطاء ساخن.

2.2.4. أضف 3 ميكرول من (أحمر) USER & reg Enzyme إلى خليط الربط من الخطوة 2.2.3.

ملاحظة: الخطوات 2.2.4. و 2.2.5. مطلوبة فقط للاستخدام مع محولات NEBNext. يمكن العثور على إنزيم المستخدم في NEBNext Singleplex (NEB # E7350) أو Multiplex (NEB # E7335 ، # E7500 ، # E7710 ، # E7730 ، # E7600 ، # E7535 و # E6609) Oligos لـ Illumina.

2.2.5. تخلط جيداً وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع ضبط الغطاء على درجة حرارة & 47 درجة مئوية.

يمكن تخزين العينات بين عشية وضحاها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

2.3 اختيار حجم الحمض النووي المرتبط بالمحول لإدخال الحمض النووي و GT 100 نانوغرام.

إذا كانت مادة البداية هي & gt 100 نانوغرام ، فاتبع بروتوكول اختيار الحجم أدناه. بالنسبة للإدخالات & lt 100 نانوغرام ، لا يوصى بتحديد الحجم. اتبع بروتوكول التنظيف بدون تحديد الحجم في الفصل 1 ، القسم 1.3. إذا كنت تريد أحجام الأجزاء و gt 550 bp وكان الإدخال الخاص بك هو & gt 100 ، فاتبع البروتوكول بأكمله في الفصل 3


ملاحظة: أحجام SPRIselect أو حبات تنقية عينة NEBNext المتوفرة هنا للاستخدام مع العينة الموجودة في المخزن المؤقت الدقيق في هذه الخطوة (71.5 & microl الخطوة 2.2.5.). قد لا تعمل وحدات التخزين هذه بشكل صحيح لتحديد الحجم في خطوة مختلفة في سير العمل ، أو إذا كان هذا هو تحديد الحجم الثاني. لاختيار حجم العينات الواردة في ظروف المخزن المؤقت المختلفة قد تحتاج أحجام حبة إلى تحديد تجريبيًا.


بروتوكول اختيار الحجم التالي خاص بالمكتبات التي تحتوي على 150-200 نقطة أساس فقط. بالنسبة للمكتبات ذات الأحجام المختلفة لإدراج الأجزاء ، راجع الجدول 2.3.1. أدناه للحصول على الأحجام المناسبة من الخرز المراد إضافتها. يعتمد بروتوكول اختيار الحجم على حجم بدء من 100 وماكرول. تم تحسين ظروف اختيار الحجم باستخدام SPRIselect أو NEBNext عينات تنقية الخرز ، ومع ذلك ، يمكن استخدام خرز AMPure XP وفقًا لنفس الظروف. إذا كنت تستخدم خرز AMPure XP ، فيرجى ترك الخرزات حتى تصل درجة حرارتها إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.

لتحديد حجم إدخال مختلف عن 200 نقطة أساس ، يرجى استخدام المجلدات الموجودة في هذا الجدول:

الجدول 2.3.1: الشروط الموصى بها لاختيار الحجم على أساس حبة.

تقريبي
أدخل توزيع الحجم
150-250 نقطة أساس 200-350 نقطة أساس 275-475 نقطة أساس 350-600 سنة مضت
مكتبة
العوامل
تقريبا. التوزيع النهائي لحجم المكتبة (إدراج + محول + برايمر)
270-370 سنة مضت 320-470 سنة مضت
400-600 نقطة أساس
470-800 نقطة أساس
الحجم إلى
تضاف (ميكرول)
اختيار الخرزة الأولى
40 30 25 20
اختيار حبة الثانية
20 15 10 10

2.3.1. اجعل حجم التفاعل يصل إلى 100 وميكرول بإضافة 28.5 وماكرول 0.1X TE (تمييع 1X TE Buffer 1:10 بالماء).

2.3.2. Vortex SPRIselect أو NEBNext عينات تنقية الخرز لإعادة التعليق.

2.3.3. إضافة 40 & mul (0.4X) حبات معلقة إلى عينة 100 & microl من الخطوة 2.3.1. تخلط جيدًا عن طريق الماصات لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل. احرص على طرد كل السائل من الحافة أثناء المزيج الأخير. يمكن أيضًا استخدام Vortexing لمدة 3-5 ثوانٍ في الأعلى. إذا تم طرد العينات بعد الخلط ، فتأكد من إيقاف الطرد المركزي قبل أن تبدأ الكريات في الاستقرار.

2.3.4. احتضان العينات لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

2.3.5. ضع الأنبوب / اللوحة على حامل مغناطيسي مناسب لفصل حبات من المادة طافية. إذا لزم الأمر ، قم بتدوير العينة بسرعة لجمع السائل من جوانب الأنبوب أو آبار اللوحة قبل وضعها على الحامل المغناطيسي.

2.3.6. بعد 5 دقائق (أو عندما يكون المحلول واضحًا) ، انقل المادة الطافية بعناية (

140 & microl) تحتوي على الحمض النووي الخاص بك إلى أنبوب جديد. (تنبيه: لا تتخلص من المادة الطافية). تخلص من الخرزات التي تحتوي على الأجزاء الكبيرة غير المرغوب فيها.

0.2X) معلق SPRIselect أو حبات تنقية العينة إلى المادة الطافية وتخلط 10 مرات على الأقل. احرص على طرد كل السائل من الحافة أثناء المزيج الأخير. احتضان العينات على سطح البدلاء لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

2.3.8. ضع الأنبوب / اللوحة على حامل مغناطيسي مناسب لفصل حبات من المادة طافية. إذا لزم الأمر ، قم بتدوير العينة بسرعة لجمع السائل من جوانب الأنبوب أو آبار اللوحة قبل وضعها على الحامل المغناطيسي.

2.3.9. بعد 5 دقائق (أو عندما يكون المحلول صافياً) ، قم بإزالة وتجاهل المادة الطافية التي تحتوي على حمض نووي غير مرغوب فيه. احرص على عدم تعكير صفو الخرزات التي تحتوي على الحمض النووي المطلوب (تحذير: لا تتخلص من الخرز).

2.3.10. أضف 200 و 80٪ من الإيثانول الطازج المحضر إلى الأنبوب / اللوحة أثناء التواجد في الحامل المغناطيسي. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية ، ثم قم بإزالة وتجاهل المادة طافية بعناية. احرص على عدم تعكير صفو الخرزات التي تحتوي على أهداف الحمض النووي.

2.3.11. كرر الخطوة 2.3.10. مرة واحدة ليصبح المجموع لغسلتين. تأكد من إزالة كل السوائل المرئية بعد الغسيل الثاني. إذا لزم الأمر ، قم بتدوير الأنبوب / اللوحة لفترة وجيزة ، ثم ضعها مرة أخرى على المغناطيس وقم بإزالة آثار الإيثانول مع طرف ماصة p10.

2.3.12. قم بتجفيف الحبيبات في الهواء لمدة تصل إلى 5 دقائق بينما يكون الأنبوب / اللوحة على الحامل المغناطيسي مع فتح الغطاء.

تحذير: لا تفرط في تجفيف الخرز. قد يؤدي هذا إلى انخفاض معدل استرداد الحمض النووي. أزل العينات عندما تكون الحبيبات لا تزال بنية داكنة وذات مظهر لامع ، ولكن عندما يتبخر كل السائل المرئي. عندما تتحول الخرزات إلى اللون البني الفاتح وتبدأ في التشقق ، فإنها تكون جافة جدًا.

2.3.13. قم بإزالة الأنبوب / اللوحة من الحامل المغناطيسي. أزل هدف الحمض النووي من الخرزات بإضافة 17 & mul 0.1X TE (تمييع 1X TE Buffer 1:10 في الماء).

2.3.14. تخلط جيدا عن طريق الماصات صعودا وهبوطا 10 مرات ، أو في خلاط دوامة. احتضان لمدة دقيقتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة. إذا لزم الأمر ، قم بتدوير العينة بسرعة لجمع السائل من جوانب الأنبوب أو آبار اللوحة قبل إعادة وضعها على الحامل المغناطيسي.

2.3.15. ضع الأنبوب / اللوحة على الحامل المغناطيسي. بعد 5 دقائق (أو عندما يكون المحلول صافيًا) ، انقل 15 و mul إلى أنبوب PCR جديد.

2.3.16. انتقل إلى تخصيب PCR للحمض النووي المرتبط بالمحول في القسم 2.4.

يمكن تخزين العينات في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

2.4 تخصيب PCR للحمض النووي المرتبط بالمحول

اتبع القسم 2.4.1A. إذا كنت تستخدم الأوليجوس التالي (10 & microM): NEBNext Singleplex Oligos for Illumina (NEB # E7350)
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (المجموعة 1 ، NEB # E7335)
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (المجموعة 2 ، NEB # E7500)
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (المجموعة 3 ، NEB # E7710)
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (المجموعة 4 ، NEB # E7730)
NEBNext Multiplex Oligos لـ Illumina (بادئات ذات مؤشر مزدوج ، NEB # E7600)

اتبع القسم 2.4.1 ب. إذا كنت تستخدم NEBNext Multiplex Oligos لـ Illumina (96 Index Primers ، NEB # E6609)

2.4.1. أضف المكونات التالية إلى أنبوب شريطي معقم:

2.4.1 أ. لم يتم دمج البرايمرات الأمامية والعكسية بالفعل

شظايا DNA المربوطة المحول (الخطوة 2.3.16.)
15 وماكرول
(أزرق) NEBNext Ultra II Q5 Master Mix
25 وماكرول
(أزرق) Index Primer / i7 Primer * ، **
5 وماكرول
(أزرق) Universal PCR Primer / i5 Primer * ***
5 وماكرول
الحجم الكلي
50 وماكرول

2.4.1 ب. تم الجمع بين البرايمر الأمامية والعكسية بالفعل

شظايا DNA المربوطة المحول (الخطوة 2.3.16.)
15 وماكرول
/> (أزرق) NEBNext Ultra II Q5 Master Mix
25 وماكرول
/> (أزرق) فهرس / يونيفرسال برايمر ****
10 وماكرول
الحجم الكلي
50 وماكرول

* يتم توفير البادئات في NEBNext Singleplex (NEB # E7350) أو Multiplex (NEB # E7335، # E7500، # E7710، # E7730، # E7600) Oligos for Illumina. للاستخدام مع Dual Index Primers (NEB # E7600) ، انظر إلى دليل NEB # E7600 لتركيبات الباركود الصالحة ونصائح لإعداد تفاعلات PCR.

** للاستخدام مع NEBNext Multiplex Oligos (NEB # E7335 أو # E7500 أو # E7710 أو # E7730) استخدم فقط مؤشرًا تمهيديًا واحدًا لكل تفاعل PCR. للاستخدام مع البادئات ذات المؤشر المزدوج (NEB # E7600) ، استخدم أساسًا واحدًا فقط لكل تفاعل.

*** للاستخدام مع البادئات الأساسية المزدوجة (NEB # E7600) ، استخدم أساسًا واحدًا فقط لكل تفاعل.

**** البادئات متوفرة في NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (NEB # E6609). يرجى الرجوع إلى دليل NEB # E6609 للحصول على مجموعات الباركود الصالحة ونصائح لإعداد تفاعلات PCR.

2.4.2. اضبط ماصة 100 & microl أو 200 & microl على 40 & microl ثم ماصة الحجم بالكامل لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل لخلطها جيدًا. قم بتدوير سريع لجمع كل السوائل من جوانب الأنبوب.

2.4.3. ضع الأنبوب على جهاز تدوير حراري وقم بإجراء تضخيم PCR باستخدام شروط ركوب الدراجات PCR التالية:

خطوة الدورة
مؤقت زمن
الدورات
الأولي تمسخ
98 درجة مئوية 30 ثانية
1
تمسخ
التلدين / التمديد
98 درجة مئوية
65 درجة مئوية
10 ثواني
75 ثانية
3-7*
التمديد النهائي
65 درجة مئوية 5 دقائق 1
معلق 4 درجة مئوية & ما لا نهاية

* يجب النظر إلى عدد دورات PCR الموصى بها في الجدول 2.4.1 كنقطة بداية لتحديد عدد دورات PCR الأفضل لعينات إعداد المكتبة القياسية. استخدم الجدول 2.4.2 للتطبيقات التي تتطلب عائدات مكتبة عالية ، مثل التخصيب المستهدف. يجب اختيار عدد دورات PCR بناءً على كمية المدخلات ونوع العينة. وبالتالي ، قد تتطلب العينات المحضرة بطريقة مختلفة قبل إعداد المكتبة إعادة تحسين عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل. يجب أن يكون عدد الدورات مرتفعًا بما يكفي لتوفير أجزاء مكتبة كافية لتشغيل تسلسل ناجح ، ولكن منخفضًا بدرجة كافية لتجنب آثار PCR والإفراط في الدوران (شظايا ذات وزن جزيئي مرتفع على Bioanalyzer).

الجدول 2.4.1


* تم تحديد رقم الدورة لحجم المكتبات المختارة.
** تحتوي محولات NEBNext على تصميم مبتور فريد. تتطلب المكتبات التي تم إنشاؤها باستخدام محولات NEBNext ما لا يقل عن 3 دورات تضخيم لإضافة تسلسلات المحول الكاملة للعمليات النهائية.


* تم تحديد رقم الدورة لحجم المكتبات المختارة.

2.4.4. تابع تنظيف تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في القسم 2.5.

2.5 تنظيف تفاعل PCR

ملاحظة: أحجام SPRIselect أو حبات تنقية عينة NEBNext المتوفرة هنا للاستخدام مع العينة الموجودة في المخزن المؤقت الدقيق في هذه الخطوة. يمكن أيضًا استخدام حبات AMPure XP. في حالة استخدام خرز AMPure XP ، اترك الخرزات حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. قد لا تعمل وحدات التخزين هذه بشكل صحيح للتنظيف في خطوة مختلفة في سير العمل. لتنظيف العينات الواردة في ظروف المخزن المؤقت المختلفة ، قد تحتاج إلى تحديد وحدات التخزين تجريبياً.

2.5.1. Vortex SPRIselect أو NEBNext حبات تنقية العينة لإعادة التعليق.

2.5.2. إضافة 45 & مول (0.9X) حبات معلقة لتفاعل PCR. تخلط جيدًا عن طريق الماصات لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل. احرص على طرد كل السائل من الحافة أثناء المزيج الأخير. يمكن أيضًا استخدام Vortexing لمدة 3-5 ثوانٍ في الأعلى. إذا تم طرد العينات بعد الخلط ، فتأكد من إيقاف الطرد المركزي قبل أن تبدأ الكريات في الاستقرار.

2.5.3. احتضان العينات على مقاعد البدلاء لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

2.5.4. ضع الأنبوب / اللوحة على حامل مغناطيسي مناسب لفصل حبات من المادة طافية. إذا لزم الأمر ، قم بتدوير العينة بسرعة لجمع السائل من جوانب الأنبوب أو آبار اللوحة قبل وضعها على الحامل المغناطيسي.

2.5.5. بعد 5 دقائق (أو عندما يكون المحلول صافياً) ، قم بإزالة المادة الطافية وتجاهلها بعناية. احرص على عدم تعكير صفو الخرزات التي تحتوي على أهداف الحمض النووي (تحذير: لا تتخلص من الخرز).

2.5.6. أضف 200 و 80٪ من الإيثانول الطازج المحضر إلى الأنبوب / اللوحة أثناء التواجد في الحامل المغناطيسي. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية ، ثم قم بإزالة وتجاهل المادة طافية بعناية. احرص على عدم تعكير صفو الخرزات التي تحتوي على أهداف الحمض النووي.

2.5.7. كرر الخطوة 2.5.6. مرة واحدة ليصبح المجموع لغسلتين. تأكد من إزالة كل السوائل المرئية بعد الغسيل الثاني. إذا لزم الأمر ، قم بتدوير الأنبوب / اللوحة لفترة وجيزة ، ثم ضعها مرة أخرى على المغناطيس وقم بإزالة آثار الإيثانول مع طرف ماصة p10.

2.5.8. قم بتجفيف الحبيبات في الهواء لمدة تصل إلى 5 دقائق بينما يكون الأنبوب / اللوحة على الحامل المغناطيسي مع فتح الغطاء.

تحذير: لا تفرط في تجفيف الخرز. قد يؤدي هذا إلى انخفاض معدل استرداد الحمض النووي. أزل العينات عندما تكون الحبيبات لا تزال بنية داكنة وذات مظهر لامع ، ولكن عندما يتبخر كل السائل المرئي. عندما تتحول الخرزات إلى اللون البني الفاتح وتبدأ في التشقق ، فإنها تكون جافة جدًا.

2.5.9. قم بإزالة الأنبوب / اللوحة من الحامل المغناطيسي. أزل هدف الحمض النووي من الخرزات بإضافة 33 & مول من 0.1X TE (تمييع 1X TE Buffer 1:10 في الماء).

2.5.10. تخلط جيدًا عن طريق الماصات لأعلى ولأسفل 10 مرات ، أو في خلاط دوامة. احتضان لمدة دقيقتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة. إذا لزم الأمر ، قم بتدوير العينة بسرعة لجمع السائل من جوانب الأنبوب أو آبار اللوحة قبل إعادة وضعها على الحامل المغناطيسي.

2.5.11. ضع الأنبوب / اللوحة على الحامل المغناطيسي. بعد 5 دقائق (أو عندما يكون المحلول صافيًا) ، انقل 30 و mul إلى أنبوب PCR جديد وقم بتخزينه في & ndash20 & degC.

2.6. قم بتقييم جودة المكتبة على محلل بيولوجي

2.6.1. مكتبة مخففة (من الخطوة 2.5.11) 5 أضعاف في 0.1X TE Buffer.

2.6.2. قم بتشغيل 1 و microl على شريحة DNA عالية الحساسية.

2.6.3. تحقق من أن حجم المكتبة يُظهر توزيعًا ضيقًا مع حجم ذروة متوقع بناءً على وقت التجزئة واختيار الحجم (الشكل 2.2).

يمكن رؤية 80 نقطة أساس (بادئات) أو 128 نقطة أساس (محول ديمر) في تتبع Bioanalyzer ، قم بإحضار حجم العينة (من الخطوة 2.5.11.) إلى 50 & microl مع 0.1X TE Buffer وكرر تنظيف تفاعل PCR في القسم 2.5

الشكل 2.2: مثال على توزيعات حجم المكتبة النهائية مع اختيار الحجم. تم تجزئة الحمض النووي البشري (NA19240) لمدة 5 أو 15 دقيقة.


بروتوكول مجموعة إعداد مكتبة DNA FS (E7805 ، E6177) مع مدخلات 100 نانوغرام

1.1.2. دوامة Ultra II FS Enzyme Mix قبل 5-8 ثوانٍ من الاستخدام ووضعها على الجليد.

ملحوظة: من المهم عمل دوامة لمزيج الإنزيم قبل استخدامه لتحقيق الأداء الأمثل.

الشكل 1.1: مثال لتوزيع الحجم على محلل بيولوجي و reg. تم تجزئة الحمض النووي البشري (NA19240) لمدة 5-40 دقيقة.

1.1.3. أضف المكونات التالية إلى أنبوب PCR رفيع الجدار 0.2 مل على الجليد:

مكون
الحجم لكل مكتبة
الحمض النووي 26 و مول
(أصفر) محلول رد فعل NEBNext Ultra II FS
7 & مول
(أصفر) مزيج إنزيم NEBNext Ultra II FS
2 و مول
الحجم الكلي
35 و مول

1.1.4. دوامة رد الفعل لمدة 5 ثوان وتدور لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي.

1.1.5. في Thermocycler ، مع ضبط الغطاء المسخن على 75 درجة مئوية ، قم بتشغيل البرنامج التالي:

5 & ​​ndash30 دقيقة @ 37 درجة مئوية
30 دقيقة @ 65 درجة مئوية
عقد @ 4 & درجة مئوية

إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين العينات في & ndash20 درجة مئوية ومع ذلك ، فقد طفيف في المحصول (

20٪). نوصي بالاستمرار في ربط المحول قبل التوقف.

حدد ما إذا كان تخفيف المهايئ ضروريًا.

إذا كان إدخال الحمض النووي هو & lt 100 نانوغرام ، قم بتخفيف (أحمر) محول NEBNext لـ Illumina في 10 مم Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5-8.0 مع 10 ملي كلوريد الصوديوم كما هو موضح في الجدول 1.2.1.

الجدول 1.2.1: تخفيف المحول

إدخال
محول التخفيف
(حجم المحول: إجمالي
الصوت)
محول العمل
تركيز
100 نانوغرام - 500 نانوغرام
لا تمييع
15 و microM
5 نانوغرام - 99 نانوغرام
10 أضعاف (1:10)
1.5 وميكرو إم
أقل من 5 نانوغرام
25 ضعفًا (1:25)
0.6 و microM

ملاحظة: قد يلزم تحسين المحول المناسب لإدخال العينة ونوعها بشكل تجريبي. التخفيفات المقدمة هنا هي نقطة انطلاق عامة.

1.2.1. أضف المكونات التالية مباشرة إلى خليط تفاعل FS:

مكون الصوت
خليط تفاعل FS (الخطوة 1.1.5)
35 وماكرول
(باللون الأحمر) NEBNext Ultra II Ligation Master Mix *
30 وماكرول
(أحمر) محسن ربط NEBNext
1 وماكرول
(أحمر) محول NEBNext لـ Illumina **
2.5 وماكرول
الحجم الكلي
68.5 وماكرول

* امزج Ultra II Ligation Master Mix عن طريق الماصات لأعلى ولأسفل عدة مرات قبل إضافتها إلى التفاعل.
** يتم توفير محول NEBNext في NEBNext Singleplex (NEB # E7350) أو Multiplex (NEB # E7335، # E7500، # E7710، # E7730، # E7600، # E7535 و # E6609) Oligos for Illumina.

ملاحظة: يمكن خلط مزيج الربط الرئيسي ومحسن الربط في وقت مبكر وهو مستقر لمدة 8 ساعات على الأقل عند 4 درجة مئوية. لا نوصي بإضافة محول إلى مزيج مسبق في خطوة ربط المحول.

1.2.2. اضبط ماصة 100 & microl أو 200 & microl على 50 & microl ثم ماصة الحجم بالكامل لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل لخلطها جيدًا. قم بتدوير سريع لجمع كل السوائل من جوانب الأنبوب. (تحذير: المزيج الرئيسي للربط NEBNext Ultra II شديد اللزوجة. يجب توخي الحذر لضمان الخلط المناسب لتفاعل الربط ، حيث سيؤدي الخلط غير الكامل إلى تقليل كفاءة الربط. ولن يتعارض وجود كمية صغيرة من الفقاعات مع الأداء ).

1.2.3. احتضان عند 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في جهاز التدوير الحراري مع غطاء ساخن.

1.2.4. أضف 3 ميكرول من (أحمر) USER & reg Enzyme إلى خليط الربط من الخطوة 1.2.3.

ملاحظة: الخطوات 1.2.4. و 1.2.5. مطلوبة فقط للاستخدام مع محولات NEBNext. يمكن العثور على إنزيم المستخدم في NEBNext Singleplex (NEB # E7350) أو Multiplex (NEB # E7335 ، # E7500 ، # E7710 ، # E7730 ، # E7600 ، # E7535 و # E6609) Oligos لـ Illumina.

1.2.5. تخلط جيداً وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع ضبط الغطاء على درجة حرارة & 47 درجة مئوية.

يمكن تخزين العينات بين عشية وضحاها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

1.3 اختيار الحجم أو تنظيف الحمض النووي المرتبط بالمحول

القسم التالي لتنظيف تفاعل الربط للمدخلات & 100 نانوغرام. إذا كان DNA المدخل الخاص بك هو & gt 100 نانوغرام ، فاتبع بروتوكول اختيار الحجم في الفصل 2 ، القسم 2.3. إذا كنت تريد أحجام الأجزاء & gt 550 bp وكان الإدخال هو & ge 100 نانوغرام ، فاتبع البروتوكول بأكمله في الفصل 3.

ملاحظة: أحجام SPRIselect أو حبات تنقية عينة NEBNext المتوفرة هنا للاستخدام مع العينة الموجودة في المخزن المؤقت الدقيق في هذه الخطوة (71.5 & microl الخطوة 1.2.5.). يمكن استخدام حبات AMPure XP أيضًا. في حالة استخدام حبات AMPure XP ، اترك الخرزات حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. قد لا تعمل أحجام الخرزة هذه بشكل صحيح للتنظيف في خطوة مختلفة في سير العمل ، أو إذا كانت هذه عملية تنظيف ثانية في هذه الخطوة. لتنظيف العينات الواردة في ظروف المخزن المؤقت المختلفة ، قد تحتاج إلى تحديد وحدات التخزين تجريبياً.

1.3.1. Vortex SPRIselect أو NEBNext عينات تنقية الخرز لإعادة التعليق.

1.3.2. أضف 57 & mul (0.8X) حبات معلقة إلى تفاعل ربط المحول. تخلط جيدًا عن طريق الماصات لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل. احرص على طرد كل السائل من الحافة أثناء المزيج الأخير. يمكن أيضًا استخدام Vortexing لمدة 3-5 ثوانٍ في الأعلى. إذا تم طرد العينات بعد الخلط ، فتأكد من إيقاف الطرد المركزي قبل أن تبدأ الكريات في الاستقرار.

1.3.3. احتضان العينات لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

1.3.4. ضع الأنبوب / اللوحة على حامل مغناطيسي مناسب لفصل حبات من المادة طافية. إذا لزم الأمر ، قم بتدوير العينة بسرعة لجمع السائل من جوانب الأنبوب أو آبار اللوحة قبل وضعها على الحامل المغناطيسي.

1.3.5. بعد 5 دقائق (أو عندما يكون المحلول صافياً) ، قم بإزالة المادة الطافية وتجاهلها بعناية. احرص على عدم تعكير صفو الخرزات التي تحتوي على أهداف الحمض النووي (تحذير: لا تتخلص من الخرز).

1.3.6. أضف 200 و 80٪ من الإيثانول الطازج المحضر إلى الأنبوب / اللوحة أثناء التواجد في الحامل المغناطيسي. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية ، ثم قم بإزالة وتجاهل المادة طافية بعناية. احرص على عدم تعكير صفو الخرزات التي تحتوي على أهداف الحمض النووي.

1.3.7. كرر الخطوة 1.3.6. مرة واحدة ليصبح المجموع لغسلتين. تأكد من إزالة كل السوائل المرئية بعد الغسيل الثاني. إذا لزم الأمر ، قم بتدوير الأنبوب / اللوحة لفترة وجيزة ، ثم ضعها مرة أخرى على المغناطيس وقم بإزالة آثار الإيثانول مع طرف ماصة p10.

1.3.8. قم بتجفيف الحبيبات في الهواء لمدة تصل إلى 5 دقائق بينما يكون الأنبوب / اللوحة على الحامل المغناطيسي مع فتح الغطاء.

تحذير: لا تفرط في تجفيف الخرز. قد يؤدي هذا إلى انخفاض معدل استرداد الحمض النووي. أزل العينات عندما تكون الحبيبات لا تزال بنية داكنة وذات مظهر لامع ، ولكن عندما يتبخر كل السائل المرئي. عندما تتحول الخرزات إلى اللون البني الفاتح وتبدأ في التشقق ، فإنها تكون جافة جدًا.

1.3.9. قم بإزالة الأنبوب / اللوحة من الحامل المغناطيسي. أزل هدف الحمض النووي من الخرزات بإضافة 17 & mul 0.1X TE (تمييع 1X TE Buffer 1:10 في الماء).

1.3.10. تخلط جيدا عن طريق الماصات صعودا وهبوطا 10 مرات ، أو في خلاط دوامة. احتضان لمدة دقيقتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة. إذا لزم الأمر ، قم بتدوير العينة بسرعة لجمع السائل من جوانب الأنبوب أو آبار اللوحة قبل إعادة وضعها على الحامل المغناطيسي.

1.3.11. ضع الأنبوب / اللوحة على الحامل المغناطيسي. بعد 5 دقائق (أو عندما يكون المحلول صافيًا) ، انقل 15 و mul إلى أنبوب PCR جديد.

1.3.12. انتقل إلى تخصيب PCR للحمض النووي المرتبط بالمحول في القسم 1.4.

يمكن تخزين العينات بين عشية وضحاها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

1.4 تخصيب PCR للحمض النووي المرتبط بالمحول

اتبع القسم 1.4.1 أ. إذا كنت تستخدم الأوليجوس التالي (10 & microM):
NEBNext Singleplex Oligos for Illumina (NEB # E7350)
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (المجموعة 1 ، NEB # E7335)
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (المجموعة 2 ، NEB # E7500)
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (المجموعة 3 ، NEB # E7710)
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (المجموعة 4 ، NEB # E7730)
NEBNext Multiplex Oligos لـ Illumina (بادئات ذات مؤشر مزدوج ، NEB # E7600)

اتبع القسم 1.4.1 ب. إذا كنت تستخدم NEBNext Multiplex Oligos لـ Illumina (96 Index Primers ، NEB # E6609)

1.4.1. أضف المكونات التالية إلى أنبوب شريطي معقم:

1.4.1 أ. لم يتم دمج البرايمرات الأمامية والعكسية بالفعل

شظايا DNA المربوطة المحول (الخطوة 1.3.12.)
15 وماكرول
(أزرق) NEBNext Ultra II Q5 Master Mix
25 وماكرول
(أزرق) Index Primer / i7 Primer * ، **
5 وماكرول
(أزرق) Universal PCR Primer / i5 Primer * ***
5 وماكرول
الحجم الكلي
50 وماكرول

1.4.1 ب. تم الجمع بين البرايمر الأمامية والعكسية بالفعل

شظايا DNA المربوطة المحول (الخطوة 1.3.12.)
15 وماكرول
/> (أزرق) NEBNext Ultra II Q5 Master Mix
25 وماكرول
/> (أزرق) فهرس / يونيفرسال برايمر ****
10 وماكرول
الحجم الكلي
50 وماكرول

* يتم توفير البادئات في NEBNext Singleplex (NEB # E7350) أو Multiplex (NEB # E7335، # E7500، # E7710، # E7730، # E7600) Oligos for Illumina. للاستخدام مع Dual Index Primers (NEB # E7600) ، انظر إلى دليل NEB # E7600 لتركيبات الباركود الصالحة ونصائح لإعداد تفاعلات PCR.

** للاستخدام مع NEBNext Multiplex Oligos (NEB # E7335 أو # E7500 أو # E7710 أو # E7730) استخدم فقط مؤشرًا تمهيديًا واحدًا لكل تفاعل PCR. للاستخدام مع البادئات ذات المؤشر المزدوج (NEB # E7600) ، استخدم أساسًا واحدًا فقط لكل تفاعل.

*** للاستخدام مع البادئات الأساسية المزدوجة (NEB # E7600) ، استخدم أساسًا واحدًا فقط لكل تفاعل.

**** البادئات متوفرة في NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (NEB # E6609). يرجى الرجوع إلى دليل NEB # E6609 للحصول على مجموعات الباركود الصالحة ونصائح لإعداد تفاعلات PCR.

1.4.2. اضبط ماصة 100 & microl أو 200 & microl على 40 & microl ثم ماصة الحجم بالكامل لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل لخلطها جيدًا. قم بتدوير سريع لجمع كل السوائل من جوانب الأنبوب.

1.4.3. ضع الأنبوب على جهاز تدوير حراري وقم بإجراء تضخيم PCR باستخدام شروط ركوب الدراجات PCR التالية:

خطوة الدورة
مؤقت زمن
الدورات
الأولي تمسخ
98 درجة مئوية 30 ثانية
1
تمسخ
التلدين / التمديد
98 درجة مئوية
65 درجة مئوية
10 ثواني
75 ثانية
3-13*
التمديد النهائي
65 درجة مئوية 5 دقائق 1
معلق 4 درجة مئوية & ما لا نهاية

* يجب النظر إلى عدد دورات PCR الموصى بها في الجدول 1.4.1 كنقطة بداية لتحديد عدد دورات PCR الأفضل لعينات إعداد المكتبة القياسية. استخدم الجدول 1.4.2 للتطبيقات التي تتطلب عائدات مكتبة عالية ، مثل التخصيب المستهدف. يجب اختيار عدد دورات PCR بناءً على كمية المدخلات ونوع العينة. وبالتالي ، قد تتطلب العينات المحضرة بطريقة مختلفة قبل إعداد المكتبة إعادة تحسين عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل. يجب أن يكون عدد الدورات مرتفعًا بما يكفي لتوفير أجزاء مكتبة كافية لتشغيل تسلسل ناجح ، ولكن منخفضًا بما يكفي لتجنب آثار تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والإفراط في الدوران (شظايا ذات وزن جزيئي مرتفع على Bioanalyzer).

1.4.4. الشروع في تنظيف تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في القسم 1.5.

1.5 تنظيف تفاعل PCR

ملاحظة: أحجام SPRIselect أو حبات تنقية عينة NEBNext المتوفرة هنا للاستخدام مع العينة الموجودة في المخزن المؤقت الدقيق في هذه الخطوة. يمكن أيضًا استخدام حبات AMPure XP. في حالة استخدام خرز AMPure XP ، اترك الخرزات حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. قد لا تعمل وحدات التخزين هذه بشكل صحيح للتنظيف في خطوة مختلفة في سير العمل. بالنسبة لعمليات تنظيف العينات الموجودة في ظروف المخزن المؤقت المختلفة ، قد يلزم تحديد وحدات التخزين بشكل تجريبي.

1.5.1. Vortex SPRIselect أو NEBNext حبات تنقية العينة لإعادة التعليق.

1.5.2. إضافة 45 & مول (0.9X) حبات معلقة لتفاعل PCR. تخلط جيدًا عن طريق الماصات لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل. احرص على طرد كل السائل من الحافة أثناء المزيج الأخير. يمكن أيضًا استخدام Vortexing لمدة 3-5 ثوانٍ في الأعلى. إذا تم طرد العينات بعد الخلط ، فتأكد من إيقاف الطرد المركزي قبل أن تبدأ الكريات في الاستقرار.

1.5.3. احتضان العينات على مقاعد البدلاء لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

1.5.4. ضع الأنبوب / اللوحة على حامل مغناطيسي مناسب لفصل حبات من المادة طافية. إذا لزم الأمر ، قم بتدوير العينة بسرعة لجمع السائل من جوانب الأنبوب أو آبار اللوحة قبل وضعها على الحامل المغناطيسي.

1.5.5. بعد 5 دقائق (أو عندما يكون المحلول صافياً) ، قم بإزالة المادة الطافية وتجاهلها بعناية. احرص على عدم تعكير صفو الخرزات التي تحتوي على أهداف الحمض النووي (تحذير: لا تتخلص من الخرز).

1.5.6. أضف 200 و 80٪ من الإيثانول الطازج المحضر إلى الأنبوب / اللوحة أثناء التواجد في الحامل المغناطيسي. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية ، ثم قم بإزالة وتجاهل المادة طافية بعناية. احرص على عدم تعكير صفو الخرزات التي تحتوي على أهداف الحمض النووي.

1.5.7. كرر الخطوة 1.5.6. once for a total of two washes. Be sure to remove all visible liquid after the second wash. If necessary, briefly spin the tube/plate, place back on the magnet and remove traces of ethanol with a p10 pipette tip.

1.5.8. Air dry the beads for up to 5 minutes while the tube/plate is on the magnetic stand with the lid open.

Caution: Do not over-dry the beads. This may result in lower recovery of DNA. Elute the samples when the beads are still dark brown and glossy looking, but when all visible liquid has evaporated. When the beads turn lighter brown and start to crack they are too dry.

1.5.9. Remove the tube/plate from the magnetic stand. Elute the DNA target from the beads by adding 33 &mul of 0.1X TE (dilute 1X TE Buffer 1:10 in water).

1.5.10. Mix well by pipetting up and down 10 times, or on a vortex mixer. Incubate for at least 2 minutes at room temperature. If necessary, quickly spin the sample to collect the liquid from the sides of the tube or plate wells before placing back on the magnetic stand.

1.5.11. Place the tube/plate on the magnetic stand. After 5 minutes (or when the solution is clear), transfer 30 &mul to a new PCR tube and store at &ndash20°C.

1.6 Assess Library Quality on a Bioanalyzer

1.6.1. Dilute library (from Step 1.5.11.) 5-fold in 0.1X TE Buffer (inputs &le 1 ng may not require dilution to run on a Bioanalyzer).

1.6.2. Run 1 µl on a DNA High Sensitivity Chip.

1.6.3. Check that the library size shows a narrow distribution with an expected peak size based on fragmentation time (Figure 1.2).

80 bp (primers) or 128 bp (adaptor-dimer) is visible in the Bioanalyzer trace, bring up the sample volume (from Step 1.5.11.) to 50 µl with 0.1X TE Buffer and repeat the Cleanup of PCR Reaction in Section 1.5. You may see adaptor-dimer when starting with inputs &le 1 ng

Figure 1.2: Example of final library size distributions without size selection. Human DNA (NA19240) was fragmented for 5-40 minutes.


معلومات الكاتب

These authors contributed equally: J. Blackburn, T. Wong.

الانتماءات

Genomics and Epigenetics Division, Garvan Institute of Medical Research, Sydney, Australia

James Blackburn, Ted Wong, Bindu Swapna Madala, Chris Barker, Simon A. Hardwick, Andre L. M. Reis, Ira W. Deveson & Tim R. Mercer

St Vincent’s Clinical School, Faculty of Medicine, UNSW Australia, Sydney, Australia

James Blackburn, Simon A. Hardwick, Andre L. M. Reis, Ira W. Deveson & Tim R. Mercer

Altius Institute for Biomedical Sciences, Seattle, WA, USA

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

مساهمات

J.B., B.S.K. and C.B. contributed materials. J.B. performed the experiments. T.W., I.W.D., S.A.H. and A.L.M.R. carried out the bioinformatic analysis. J.B., T.W., I.W.D. and T.R.M. كتب المخطوطة. All authors conceived the study and contributed to manuscript preparation.

المؤلفون المراسلون


How to make a DNA ladder? a DIY guide

The ligation-based method is one of the traditional methods not used nowadays.

In the ligation-based DNA ladder development, different fragments of 100bp are covalently joined by the phosphodiester bonds that generated different fragments of 200bp to 1000bp.

The graphical representation of Ligation based DNA ladder development method.

In the restriction digestion method, the know restriction endonuclease is used to digest different fragments of DNA that generate different-sized fragments of DNA.

The digested fragments are collected, purified and can be used as a DNA ladder.

However, both the methods are outdated, costlier and time-consuming. In addition to this, the amount of fragment generated from both methods is very low.

Therefore, the need for the new method has arisen which may be cheap, rapid and most importantly generates a large amount of specific DNA fragments for the construction of DNA ladder.

We know that only PCR can generate millions of fragments in a short time.

PCR is used to generate different types of DNA fragments for the construction of a DNA ladder.

In the very first step, we have to select the plasmid. Use bacteria phage plasmid.

Now digest the plasmid with the appropriate restriction endonuclease so that the circular DNA breaks open.

Here we have selected lambda phage DNA sequence between the sequence 6631 to 7630 and designed primers according to it.

We have designed a set of primers that can amplify different fragments of DNA in a multiplex reaction.

For achieving amplification for all the fragments, we need an advance PCR reaction preparation set up.

For instance, the R1 primer is used in all the amplification, therefore we have to add it 10 times more than other primers.

You can also read our PCR reaction preparation guide to learn how to prepare an effective PCR reaction: PCR reaction: Ten secrets that nobody tells you

The present method is a combination of three different PCR methods: Hot start PCR, multiplex PCR and touch down PCR.

Amplification of all the fragments are carried out in a single reaction (multiplex), Temperature gradually decreases to increase the amplification power of PCR (touch down) and the Taq DNA polymerase used in the present experiment is added only when the reaction is started (hot start).

ملحوظة: The method is a touchdown PCR, therefore, decrease the temperature after 2 PCR cycles until the temperature reaches 44 ̊C.

After the completion of the PCR reaction, the products are loaded on the 2% agarose gel.

Want to learn how to prepare an agarose gel? read this article: Agarose gel electrophoresis

Run the gel on 80V until the DNA reaches up to the 75% distance of the gel.

10 different DNA bands are obtained from the PCR reaction and are compared with the ready to use DNA ladder.

Now, our DNA ladder is ready to use, but before that, we have to purify the fragments.

For that precipitate the fragments using the alcohol and purify it with the ready to use DNA purification kit.

You can also use the phenol-chloroform method for DNA purification (Here I prefer to use a kit based method over the PCI method).

Again dissolve the fragments in TE buffer and store it under the cooling conditions.

Now you can use 5μl of our DNA ladder for any of the gel electrophoresis experiment.

If you are not comfortable with multiplexing the reaction (because more extraordinary expertise required to achieve good results in multiplex PCR),

Then perform the PCR reaction in 10 different tubes and load it on agarose gel along with the ready to use DNA ladder for conforming results.

The results of the PCR doing in 10 different separate reactions might look like this,


شكر وتقدير

D.D.D.C. and S.V.B. were supported by the Gattuso-Slaight Personalized Cancer Medicine Fund at the Princess Margaret Cancer Centre. J.M.B. was supported by a fellowship from the Strategic Training in Transdisciplinary Radiation Science for the 21st Century (STARS21) training program. D.D.D.C. was supported by the University of Toronto McLaughlin Centre (MC-2015-02) the Canadian Institutes of Health Research (CIHR FDN 148430 and CIHR New Investigator Salary award 201512MSH-360794-228629) the Ontario Institute for Cancer Research (OICR), with funds from the province of Ontario the Canada Research Chair (950-231346) and the Helen M Cooke Professorship from the Princess Margaret Cancer Foundation. S.V.B. was supported by a Career Development Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. Any opinions, findings, and conclusions expressed in this article are those of the author(s) and do not necessarily reflect those of the American Society of Clinical Oncology or the Conquer Cancer Foundation. We acknowledge the Princess Margaret Cancer Centre Head & Neck Translational Program, supported by philanthropic funds from the Wharton Family, Joe’s Team, Gordon Tozer and the Reed Fund, as well as the labs of F.-F. Liu and G. Liu (University of Toronto), for the provision of plasma samples. We also thank the Princess Margaret Genomics Centre for carrying out the NGS sequencing and the Bioinformatics and HPC Core of the Princess Margaret Cancer Centre for expertise in generating the NGS data.


خيارات الوصول

احصل على الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


Stroke: Injury Mechanisms

أ. Singhal , . S.P. Finklestein , in Encyclopedia of Neuroscience , 2009

موت الخلايا المبرمج

Apoptosis is an evolutionarily conserved process of programmed cell death. It is characterized histologically by nuclear and cytoplasmic condensation, nuclear fragmentation, and cell shrinkage. Apoptotic cells are terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL)-positive cells that exhibit DNA laddering . Cell type, age, and brain location render them more or less resistant to apoptosis or necrosis. Since apoptotic pathways require energy in the form of ATP, apoptosis predominantly occurs in the ischemic penumbra that sustains milder injury, rather than in the core, where ATP levels are rapidly depleted. Nevertheless, ionic imbalances can also trigger apoptosis under certain conditions, suggesting a close mechanistic interrelationship between glutamate-mediated excitotoxicity and apoptosis. The normal human brain expresses caspases 1, 3, 8, and 9, apoptosis protease-activating factor-1 (APAF-1), death receptors, P53, and a number of Bcl-2 family members, all of which are implicated in apoptosis.

Caspases are protein-cleaving enzymes (zymogens) that belong to a family of cysteine aspartases constitutively expressed in adult and newborn brain cells, particularly neurons. Apoptosis occurs via caspase-dependent as well as caspase-independent mechanisms. Caspases are sequentially cleaved and activated via two pathways: an extrinsic pathway dependent on death receptors, and an intrinsic mitochondrial pathway. With regard to the extrinsic pathway, several apoptotic triggers of have been identified. These include oxygen free radicals, Bid cleavage, death receptor ligation, DNA damage, and lysosomal protease activation. The tumor necrosis factor (TNF) superfamily of death receptors, most importantly Fas, powerfully regulates upstream caspase processes. Emerging data suggest that the cell nucleus is involved in releasing signals for apoptosis, and that the mitochondrion plays a central role in mediating apoptosis. At least four mitochondrial molecules mediate downstream cell death pathways: cytochrome ج, secondary mitochondria-derived activator of caspase (Smac/Diablo), apoptosis-inducing factor (AIF), and endonuclease G. While cytochrome ج and Smac/Diablo mediate caspase-dependent apoptosis, AIF and endonuclease G mediate caspase-independent apoptosis. السيتوكروم ج binds to Apaf-1, which combines with procaspase 9 to form the ‘apoptosome’ that activates caspase 9 in the presence of dATP. In turn, caspase 9 activates caspase 3. It is important to note that formation of the apoptosome complex is inhibited by Bcl-2, which becomes upregulated very early after stroke. Smac/Diablo binds to inhibitors of activated caspases and causes further caspase activation. After activation, caspases 3 and 7 (the executioner caspases) attack and degrade various substrate proteins, ultimately leading to DNA fragmentation and irreversible cell death. Over 30 proteins can be cleaved, including the DNA-repairing enzyme poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), the cytoskeletal protein gelsolin, actin, presenilins, and other caspases. Caspase 3, the most prominent cysteine protease, is present in the infarct core as well as in the penumbra and is cleaved acutely after stroke. Subsequent caspase cleavage occurring after hours or days leads to delayed cell death.

Caspase-independent apoptosis has been shown to develop in cultured neurons by NMDA-receptor induced activation of PARP-1, and in fibroblasts exposed to oxidative stress. AIF is implicated as a key molecule in this cascade. AIF is released from mitochondria after PARP-1 activation, then relocates to the nucleus, where it binds DNA, promotes chromatin condensation, and leads to cell death via incompletely understood mechanisms. The exact significance of caspase-independent apoptosis remains to be determined.

Overexpression of Bcl-2, deletions of genes for Bid or caspase-3, and the use of caspase-3 inhibitors, peptide inhibitors, and antisense oligonucleotides that suppress the expression and activity of apoptosis-promoting genes have been shown to reduce infarct volume or decrease neurological deficits after stroke. A single intracerebroventricular injection of zDEVD-FMK, a relatively selective caspase-3 inhibitor, is shown to be neuroprotective when administered up to 9 h after transient focal stroke. However, caspase inhibitors do not reduce infarct size in all brain ischemia models. This variable effect may be attributable to different severities of ischemia, to limited potency or inability of caspase inhibitors to cross the blood–brain barrier, to the relatively minor impact of apoptosis as compared to excitotoxicity or other mechanisms on stroke outcome, and to upregulation of caspase-independent or redundant cell death pathways.


شاهد الفيديو: طريقة اضافة عينة فحص DNA في مشروع (يونيو 2022).


تعليقات:

  1. Meziramar

    فقط ما هو مطلوب ، سأشارك. معا يمكننا الوصول إلى الإجابة الصحيحة.

  2. Balthazar

    فإنه لا معنى له.

  3. Odysseus

    أتركهم يكونوا!

  4. Ricweard

    أهنئ ، هذه الفكرة الرائعة يجب أن تكون عن قصد فقط

  5. Tassa

    ألا يمكنك أن تخطئ؟

  6. Coulter

    أوافق ، هذه رسالة مضحكة.

  7. Eorlson

    في نظري انه أمر واضح. أوصي لك بالبحث في google.com



اكتب رسالة