معلومة

ما هو بروتوكول التجميد السريع المناسب لأنسجة البنكرياس؟

ما هو بروتوكول التجميد السريع المناسب لأنسجة البنكرياس؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أود أن أقوم بتجميد سريع للبنكرياس من الفئران. أرغب بعد ذلك في عمل أقسام (بسماكة 30 ميكرومتر). الفكرة هي الحفاظ على تلطيخ الفلورسنت في الجسم الحي.

لا أعرف ما إذا كان ينبغي عليّ وضع الأنسجة الطازجة مباشرة في النيتروجين السائل ، ثم تضمين الأنسجة في OCT ، ثم تجميد كل شيء في الأيزوبنتان البارد؟

أو هل يجب علي تضمين الأنسجة الطازجة في أكتوبر أولاً ، قبل وضع كل شيء في النيتروجين؟

أم أن هناك بروتوكول آخر للقيام بالتجميد السريع من أجل القيام بالتقسيم؟


قم بتضمين الأنسجة في OCT أولاً (قم بقصها تقريبًا لإزالة كل ما هو غير مطلوب) وقم بتجميد الفلاش. ثم يمكنك قص الأقسام الخاصة بك.

يصفها البروتوكول الأول بالتفصيل ، بينما يعطي الثاني بعض المعلومات الإضافية:


لا تضعه مباشرة في N2 ما لم يكن نظيفًا. والسائل عالي الجودة N2 يكلف الذراع والساق. ضع النسيج في oct في قارورة مخروطية وذلك في N2. لا تستخدم البولي فقد يتشقق. تحقق مع اقتراحات مصنعي OCT أولاً. لقد اتبعت بروتوكول BD هذا من قبل

http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/frozen_tissue.jsp


تحسين الطريقة لاستخراج الحمض النووي الريبي عالي الجودة من أنسجة البنكرياس البشري 1،2

كثيرا ما يستخدم تسلسل الحمض النووي لتحديد الأساس الجزيئي للأمراض. لذلك ، يعد التخزين السليم للعينات البيولوجية أمرًا ضروريًا لمنع تدهور الحمض النووي. الحمض النووي الريبي المعزول من البنكرياس البشري بشكل عام ذو نوعية رديئة بسبب تركيزه العالي من RNase الداخلي. في هذه الدراسة ، قمنا بتحسين طريقة استخراج الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الورم المقترن وأنسجة البنكرياس الطبيعية التي تم الحصول عليها من ثمانية مرضى بسرطان البنكرياس بعد الجراحة. تم فحص رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) لتقييم سلامة الحمض النووي الريبي ، وحاولنا استخراج الحمض النووي الريبي بقيمة RIN تبلغ 8 أو أعلى مما يسمح بأحدث التحليل الجيني. تأثير العديد من العوامل ، بما في ذلك الطريقة المستخدمة لتحلل الأنسجة ، RNAفي وقت لاحق تم فحص العلاج ، ووزن الأنسجة عند التخزين ، ووقت التخزين بعد الاستئصال الجراحي ، على كمية ونوعية الحمض النووي الريبي المستخلص. أظهرت البيانات أن أعلى كمية من الحمض النووي الريبي تم عزلها باستخدام مزيج من الطرق اليدوية والميكانيكية لتحلل الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقسيم الأنسجة إلى قطع صغيرة (& لتر 100 مجم) ومعالجتها باستخدام الحمض النووي الريبيفي وقت لاحق حل قبل التخزين زاد من استقرار الحمض النووي الريبي. باتباع هذه الإرشادات ، تم الحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي من 100٪ (8/8) من أنسجة الورم و 75٪ (6/8) من الأنسجة السليمة. كان الحمض النووي الريبي عالي الجودة لا يزال مستقرًا تحت التجميد والذوبان المتكرر. إن تطبيق هذه النتائج أثناء معالجة العينات وتخزينها في البيئات السريرية سيسهل التشخيص الجيني للأمراض وعلاجها لاحقًا.

التمويل: تم دعم هذه الدراسة بمنحة من مشروع البحث والتطوير في تكنولوجيا الصحة الكورية ، وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية ، جمهورية كوريا (رقم HI14C2640).

تضارب المصالح: يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.


بروتوكول جمع البنكرياس البشري

يوضح هذا الفيديو إجراء تشريح لمعالجة البنكرياس البشري في تنسيقات تخزين متعددة. يتم الحفاظ على التوجه التشريحي في جميع أنحاء مناطق البنكرياس للسماح بتعريف تكوين الجزيرة الإقليمية وكثافتها.

الملخص

تم تطوير إجراء التشريح وأخذ العينات هذا لبرنامج شبكة المتبرعين بأعضاء البنكرياس المصابين بمرض السكري (nPOD) لتوحيد إعداد البنكرياس المستعاد من المتبرعين بأعضاء جثث. ينقسم البنكرياس إلى 3 مناطق رئيسية (الرأس والجسم والذيل) تليها أقسام عرضية متسلسلة في جميع أنحاء المحور الإنسي إلى الجانبي. يتم استخدام المقاطع المتناوبة للبارافين الثابت والكتل المجمدة الطازجة ويتم فرم العينات المتبقية لتحضير العينات المجمدة المفاجئة ، إما مع أو بدون مثبطات RNAse ، لعزل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتين. الهدف العام من إجراء تشريح البنكرياس هو أخذ عينة من البنكرياس بالكامل مع الحفاظ على الاتجاه التشريحي.

تم الإبلاغ عن عدم تجانس خلايا الغدد الصماء من حيث تكوين الجزيرة وحجمها وأرقامها للجزر البشرية مقارنة بجزر القوارض 1. تتكون غالبية الجزر البشرية من مناطق الرأس والجسم والذيل من البنكرياس من خلايا بيتا تحتوي على الأنسولين تليها نسب أقل من خلايا ألفا المحتوية على الجلوكاجون وخلايا ألفا وخلايا الدلتا المحتوية على السوماتوستاتين. توجد أيضًا خلايا PP المحتوية على عديد ببتيد البنكرياس وخلايا إبسيلون المحتوية على الجريلين ولكن بأعداد صغيرة. في المقابل ، تحتوي المنطقة غير المحددة على جزر تتكون أساسًا من خلايا PP تحتوي على بولي ببتيد بنكرياسي 2. تنشأ هذه الاختلافات الإقليمية من الاختلافات التنموية. يتطور البنكرياس من براعم البنكرياس البطنية والظهرية في المعى الأمامي وبعد دوران المعدة والاثني عشر ، يتحرك الفص البطني ويندمج مع الظهر 3. يشكل الفص البطني الجزء الخلفي من الرأس بما في ذلك العملية غير المحددة بينما يؤدي الفص الظهري إلى ظهور باقي العضو. تم الإبلاغ أيضًا عن تباين البنكرياس الإقليمي مع منطقة الذيل ذات كثافة جزيرة أعلى مقارنة بالمناطق الأخرى والمكونات المشتقة من الفص الظهري تخضع لضمور انتقائي في داء السكري من النوع 1 4،5.

غالبًا ما يتم استرداد الأعضاء والأنسجة الإضافية من المتبرعين بالأعضاء وتشمل العقد الليمفاوية البنكرياسية والطحال والعقد الليمفاوية غير البنكرياسية. يتم استعادة هذه العينات بأشكال مماثلة للبنكرياس مع إضافة عزل الخلايا المحفوظة بالتبريد. عندما يتم تضمين العفج القريب مع البنكرياس ، يمكن جمع الغشاء المخاطي في الاثني عشر للحصول على البارافين والكتل المجمدة والمستحضرات المجمدة المفاجئة المفرومة.

بروتوكول

  1. قم بتسمية العلب الخاصة بكتل البارافين يدويًا باستخدام قلم رصاص أو تلقائيًا باستخدام طابعة كاسيت. قم بتضمين معرف المتبرع (CaseID) ، ونوع العينة ، ورقم القسمة ، وأي تعريف فريد إضافي (ورقة عمل الحالة ، الملحق 1).
  2. قوالب الملصقات OCT كما هو الحال بالنسبة لأشرطة الكاسيت بعلامة دائمة. قطع مستطيلات 5-10 سم من رقائق الألومنيوم.
  3. قم بطباعة أو الملصق يدويًا بعلامة دائمة على جميع القوارير والأنابيب. قم بتضمين قوارير كافية للعينات والأنابيب المجمدة المفاجئة المفرومة مع وسائط RPMI للشحنات الطازجة. للقوارير المجمدة المفاجئة مع RNAlater ، أضف 1 مل RNA لاحقًا إلى كل كريوفال.
  4. تركيب ألواح التشريح في غطاء السلامة البيولوجية وأسطح العدادات مع أدوات تشريح معقمة (ملاقط ، مشرط ، شفرات ، ضمادات شاش (4x4)) وكذلك شرائط كاسيت وقوالب OCT مرتبة حسب ترتيب الاستخدام.
  5. جهز حمامًا متجمدًا عن طريق وضع ثلج جاف في صندوق ستايروفوم متوسط ​​الحجم (10 × 10 سم) على عمق لا يقل عن 3 سم وأضف الأيزوبنتان حتى يتم تغطية الثلج الجاف تمامًا.
  6. اختياري: املأ حاوية صغيرة ديوار بالنيتروجين السائل.
  7. إذا كان البنكرياس مطلوبًا للفحص المجهري الإلكتروني (EM) ، فقم بإعداد مثبت TAAB بإضافة 1.25 مل 16 ٪ بارافورمالدهيد ، و 1.25 مل 8 ٪ جلوتارالدهيد ، و 7.5 مل 0.1M PBS. إعداد مثبت Lowicryl عن طريق إضافة 2.5 مل 16٪ بارافورمالدهيد إلى 7.5 مل 0.1M برنامج تلفزيوني.
  8. تحضير المحاليل المستخدمة لعزل الخلايا. إلى زجاجة 500 مل من DMEF (مع الجلوتامين) ، اتبع تقنيات التعقيم مع إضافة ما يلي:
    1. مصل بقري جنيني (FBS): أضف 50 مل ، 10٪ نهائي.
    2. البنسلين / الستربتومايسين (قلم / ستريب ، 10000 وحدة / مل / 10000 ميكروغرام / مل مخزون) - أضف 5 مل من مخزون القلم / Strep إلى RPMI للتركيز النهائي 100 وحدة / مل / 100 ميكروغرام / مل. أضف أيضًا 5 مل إلى زجاجة سعة 500 مل من DPBS عند استخدامها لعقد عينات من الغدد الليمفاوية أو الطحال.
    1. يتم تنفيذ الإجراء على النحو الأمثل مع ثلاثة موظفين ولكن يمكن إجراء الإجراء مع فرد مدرب جيدًا. يمكن لشخصين إكمال الإجراء بشكل عام في 90 دقيقة. المدة الفعلية تعتمد على عدد الأنسجة المتلقاة وسهولة العثور على العقد الليمفاوية البنكرياسية. يتم الاحتفاظ بعينات عزل الخلايا في 4 درجة مئوية حتى الانتهاء من تشريح الأنسجة بينما تتم معالجة عينات المصل بالتوازي.
    2. أخصائي علم الأمراض ، مساعد علم الأمراض ، أو ما يعادله - يقود أحد الموظفين ذوي الخبرة معالجة الأنسجة ويقوم بإجراء تشريح كبير بما في ذلك تقسيم (أقسام) رأس البنكرياس وحصاد الغدد الليمفاوية في البنكرياس. يتم توجيه الجهود الأولية نحو البنكرياس متبوعًا بفحص الدهون المحيطة بالبنكرياس للعقد الليمفاوية.
    3. تقني المختبر أو ما يعادله - موظف مدرب على تقليم الأنسجة وتتمثل مسؤولياته الأساسية في وزن البنكرياس والمناطق وتقليم الأنسجة للكتل الثابتة والمجمدة والقوارير المجمدة المفاجئة. يتلقى الاثني عشر والطحال من مساعد علم الأمراض ويعالج هذه الأعضاء بينما يقوم مساعد علم الأمراض بمعالجة البنكرياس.
    4. مساعد مختبر - موظف يساعد الآخرين بما في ذلك وضع العلامات على القارورة والكتلة ، وفرم العينات للقنوات المبردة ، ومعالجة المصل.

    1. إزالة الاثني عشر والطحال وتنظيف البنكرياس من الدهون والأوعية والأعصاب الدخيلة باستخدام تشريح حاد وحاد
    2. ضع البنكرياس النظيف على لوح تشريح مغطى بمناشف ورقية. اغمس قضيبًا قطنيًا في الحبر الأزرق وانتشر على السطح الأمامي للبنكرياس. وصمة عار قبالة الزائدة.
    3. اختياري: اغمس قضيبًا جديدًا بالحبر الأسود وافرده على السطح الخلفي للبنكرياس. إعادة البنكرياس إلى الاتجاه الطبيعي مع السطح الأمامي المواجه للبروز.
    4. قطع البنكرياس إلى 3 مناطق: الرأس والجسم والذيل (شكل 1). قطع التقاطع بين الرأس والجسم ثم قسّم الجزء المتبقي إلى

    1. افرم القطع وقسمها بالتساوي بين القارورة المبردة (& ge1 جرام لكل قارورة). قم بتجميد القوارير بسرعة بدون RNALater في النيتروجين السائل أو في الجليد الجاف - ملاط ​​الأيزوبنتان ثم نقله إلى المجمد بدرجة حرارة -80 درجة مئوية.
    2. احتفظ بالقوارير التي تحتوي على RNALater في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح بالموازنة ، وإعادة المزج والتجميد بسرعة في النيتروجين السائل أو في ملاط ​​الجليد - أيزوبنتان ، ثم نقله إلى ثلاجة -80 درجة مئوية.

    4. تشريح الطحال والعقد الليمفاوية وتشريح الغشاء المخاطي الاثني عشر

    1. عزل العقد الليمفاوية البنكرياسية (PLN) من الدهون وتقليم جميع الأنسجة الضامة إلى كبسولة العقدة. ضع في طبق الثقافة الخلوية المعقمة التي تحتوي على DMEF. اعتمادًا على العدد الإجمالي المعزول ، قسّم PLN إلى قسامات للشحنات الطازجة ، وعزل الخلايا المحفوظة بالتبريد ، وكتل البارافين و / أو OCT ، والقوارير. افرم العقد الكبيرة إلى قطع لا يزيد حجمها عن 0.5 سم.
    2. يفرم الغدد الليمفاوية غير البنكرياسية والطحال إلى أجزاء صغيرة (

    5. قم بلف كتل OCT برقائق الألمنيوم المُعلمة مسبقًا ووضع كتل وقوارير OCT في صناديق لتخزين طويل الأمد عند درجة حرارة -80 درجة مئوية.

    6. إرسال عينات ثابتة لمعالجة البارافين

    1. إصلاح المناديل لمدة 16 ساعة (المدى 20 & plusmn4 ساعات) باستخدام معالج البارافين التلقائي أو باستخدام التوقيت اليدوي. معالجة كتل البارافين باستخدام معالج آلي (الملحق 2).
    2. قم بتضمين المقاطع في الاتجاه الصحيح كما تم وضعه بواسطة المنشط مع ملصق الكاسيت على اليسار. قم بتضمين الغشاء المخاطي الاثني عشر مع السطح المقطوع لأسفل للسماح بفحص الغشاء المخاطي العمودي على الطبقة تحت المخاطية.

    7. تنظيف مناطق التشريح وتطهيرها. اغسل أدوات التشريح وأعد تعقيمها. ضع الأنسجة البشرية المتبقية في مثبت الفورمالين لتخزينها كنفايات طبية. تخلص من النفايات الطبية الحيوية وفقًا للوائح المحلية في غضون شهر واحد.

    8. تحديث نموذج نظام الجرد

    سيعالج هذا الإجراء البنكرياس البشري السليم مع أخذ عينات تمثيلية في جميع أنحاء العضو بما في ذلك ترسيم حدود المناطق الرئيسية الثلاث ، وهي الرأس والجسم والذيل في غضون ساعتين. يتم تضمين المنطقة غير المحددة ، الموجودة في منطقة الرأس الخلفية ، في تشريح الرأس. كان متوسط ​​وزن البنكرياس لدى المتبرعين بالأعضاء غير المصابين بالسكري 82.4 جرامًا (52.7 - 139.0 جرامًا). كانت أوزان البنكرياس الإقليمية متساوية تقريبًا (الشكل 3).

    يمكن أن يسمح هذا الإجراء أيضًا بإعادة بناء البنكرياس بأكمله باستخدام شرائح ملطخة من البارافين المتسلسل وكتل OCT. تنسيقات متعددة ممكنة للسماح باستخدام أقصى قدر من التقنيات الحالية والمستقبلية. يتم توفير ورقة عمل حالة nPOD الحالية (الملحق 1) والتي يتم استخدامها لتوثيق العينات المستردة والمعالجة اللاحقة بواسطة أنواع وكميات القسمة.


    الشكل 1. المخطط العام للإجراء. تتم معالجة البنكرياس بالكامل مع الحفاظ على التوجهات التشريحية. منطقة الرأس أطول في المحور العلوي السفلي بسبب وجود الفص البنكرياس البطني في المنطقة الخلفية التي تشمل المنطقة غير المحددة. تشير المنطقة التي تم فقسها عند التقاطعات إلى المناطق المستخدمة في العينات المفرومة في القارورات المبردة. P ، بارافين O ، أكتوبر.


    الشكل 2. مخطط حروف لأقسام البنكرياس. يمكن تقسيم شرائح البنكرياس المستعرضة إلى نصفين أو أرباع وكتابتها بأحرف في اتجاه عقارب الساعة.


    الشكل 3. أوزان البنكرياس من المتبرعين بالأعضاء بدون مرض السكري. تم وزن البنكرياس السليم من متبرعين بالغين (أكبر من 17 عامًا) ثم تم تقسيمه إلى مناطق وتم الحصول على أوزان إقليمية. البيانات تعني & plusmn SEM (العدد = 15).

    الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

    مناقشة

    الهدف من هذا الإجراء هو تحديد معالجة معيارية للبنكرياس يمكن تنسيقها عبر مواقع تجميع متعددة ، وبالتالي السماح بإجراء مقارنات بين النتائج التي تم الحصول عليها من قبل مجموعات مختلفة. تعتمد طريقة التشريح على ممارسات علم الأمراض الجراحية القياسية مع خطوات إضافية لتوضيح مناطق البنكرياس الرئيسية متبوعة بالتقسيمات الفرعية داخل المنطقة. مطلوب توحيد طرق معالجة العينات الحيوية لتسهيل جمع العينات عالية الجودة المتمثلة في نشر أفضل الممارسات لجمع العينات الحيوية من منظمات البنوك الحيوية الوطنية مثل المعهد الوطني للسرطان 6. تم الإبلاغ عن البنوك الحيوية لعينات البنكرياس البشري من المتبرعين الذين يمثلون مراحل مختلفة من مرض السكري ومجموعات التحكم المناسبة 7-9. ومع ذلك ، لا توجد تفاصيل دقيقة لتلك العينات التي تم جمعها من منطقة رأس البنكرياس. من المعروف جيدًا عدم تجانس الجزيرة بين الأفراد مع اختلافات تصل إلى 5 أضعاف في توزيع حجم الجزيرة بحيث يلزم شرح منطقة البنكرياس عند تحليل التغاير المتأصل 10. ستساعد معالجة عينات البنكرياس في التنسيقات الموحدة في حل عوامل المريض الفردية بحيث يمكن حل عوامل المرض الأساسية الأخرى بشكل أفضل.


    البنوك الحيوية لأنسجة سرطان البنكرياس البشري: تأثير أوقات الشراء خارج الجسم الحي على جودة الحمض النووي الريبي

    أصبح التعامل المصرفي مع الأنسجة مبادرة رئيسية في العديد من مراكز الأورام. لم يتم توثيق تأثير أوقات نقص التروية الدافئة خارج الجسم الحي وأوقات التخزين وبروتوكولات البنوك الحيوية على سلامة الحمض النووي الريبي وبيانات المصفوفة الدقيقة اللاحقة بشكل جيد.

    أساليب

    تم الشروع في بروتوكول معتمد من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للبنك لأورام البطن في مركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان في عام 2001. أربعة وستون عينة ممثلة لسرطان البنكرياس تم تجميدها في أوقات شراء مختلفة خارج الجسم الحي (10 دقائق ، 11– 30 دقيقة ، 31-60 دقيقة ، & gt1 h) وتمت معالجتها خلال ثلاث فترات زمنية (2001-2004 ، 2004-2006 ، 2006-2008). تم تحديد سلامة الحمض النووي الريبي بواسطة الرحلان الكهربائي الدقيق باستخدام خوارزمية رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) ونتائج التشريح الدقيق لالتقاط الليزر (LCM).

    نتائج

    بشكل عام ، أسفرت 42 ٪ من عينات سرطان البنكرياس البشرية المخزنة بموجب بروتوكول مخصص عن الحمض النووي الريبي مع RIN بمقدار ≥7. لم تؤثر أوقات نقص التروية الدافئة خارج الجسم الحي سلبًا على جودة الحمض النووي الريبي (النسبة المئوية للأنسجة التي تحتوي على إجمالي RNA مع RIN تبلغ 7 لمدة 10 دقائق ، و 42٪ 11-30 دقيقة ، و 58٪ 31-60 دقيقة ، و 33٪ ، و 60 دقيقة ، و 42 ٪) ، والتخزين طويل الأجل للعينات الحيوية لسرطان البنكرياس المخزن لم يؤثر سلبًا على جودة الحمض النووي الريبي (إجمالي الحمض النووي الريبي مع RIN 7 تم تخزينه 2001-2004 ، 44٪ 2004-2006 ، 38٪ 2006-2008 ، 50٪). تم استرداد الحمض النووي الريبي من عينات سرطان البنكرياس مع RIN من 7 تخضع لـ LCM مما أسفر عن الحمض النووي الريبي المناسب لمزيد من التطبيقات النهائية.

    الاستنتاجات

    تنتج أنسجة البنكرياس المجمدة الطازجة المخزنة ضمن بروتوكول بحث معياري RNA عالي الجودة في حوالي 50٪ من العينات ويمكن استخدامها للتخصيب بواسطة LCM. لم تتأثر جودة أنسجة البنك الحيوي سلباً بالاختلافات المحدودة في أوقات نقص التروية الدافئة أو فترات التخزين المختلفة. توضح هذه الدراسة التحديات والاستثمارات المطلوبة لبدء والحفاظ على مستودعات الأنسجة عالية الجودة.


    توفر العضويات الدماغية نموذجًا بشريًا وثيق الصلة من الناحية الفسيولوجية للجهاز العصبي المركزي. تتيح هذه الثقافات ثلاثية الأبعاد دراسة الحالات الطبيعية والمرضية في نمو الدماغ البشري ، بما في ذلك نماذج التوحد 1 والفصام 2 ، أو عيوب الدماغ الناتجة عن العدوى الفيروسية. 3

    تتمثل الميزة الأساسية لاستخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) في تكوين أشباه عضوية دماغية في إعادة تلخيص التنظيم ثلاثي الأبعاد للدماغ النامي. يطور النسيج العصبي المركزي في العضو الدماغي بنية ذات طبقات وبطينين زائفين ، على غرار البنية الدماغية التي تُرى في الجسم الحي. 3 من أجل التقاط هذه العمارة الخلوية وتحليلها ، يلزم وجود طرق نسيجية متخصصة.

    هناك عدد من الاعتبارات التقنية عند معالجة الأنسجة الكبيرة ثلاثية الأبعاد التي اكتسبت بنية معقدة ، مثل العضيات الدماغية. بالإضافة إلى المعالجة الدقيقة ، تتطلب هذه العضيات اختراقًا وتثبيتًا وحماية بالتبريد كافية للحفاظ على نسيجها. يمكن أن تؤثر كل خطوة من هذه الخطوات أيضًا على توصيف الأنماط الظاهرية ، من خلال الحفاظ أو تعديل بنية البروتين التي تحدد توفر الحاتمة.

    يصف البروتوكول التالي كيف يمكن معالجة العضيات الدماغية الناضجة للتقطيع بالتبريد والتألق المناعي (IF) لتقليل تلف الأنسجة والحفاظ على الحواتم المهمة. نظرًا لأن تحضير العينة له تأثير كبير على جودة تلطيخ المصب في أي بروتوكول مناعي ، فقد تعمل بعض الأجسام المضادة بشكل أفضل بموجب هذا البروتوكول باستخدام مثبتات الأنسجة القائمة على الجفاف (الجدول 1). تم تأكيد أن الأجسام المضادة المدرجة في هذه الوثيقة (الجدولان 2 و 3) تعمل مع الأنسجة العضدية الدماغية التي تم علاجها بنسبة 4٪ لامتصاص العرق من أجل التثبيت.


    تحضير العينة النسيجية للفحص المجهري الضوئي

    علم الأنسجة هو دراسة الخلايا والأنسجة ، والتي تساعد عادةً باستخدام المجهر الضوئي. يمكن أن يختلف تحضير العينات النسيجية اختلافًا كبيرًا بناءً على الخصائص المتأصلة للعينات مثل الحجم والصلابة بالإضافة إلى المعالجة اللاحقة المتوقعة والتي تتضمن تقنيات التلوين المخطط لها أو تطبيقات أخرى لاحقة. كما هو موضح في هذا الفيديو ، يبدأ تحضير العينة عادةً بإجراء تثبيت لمنع تدهور العينة عن طريق الإنزيمات التي تحدث بشكل طبيعي والتي تطلقها الخلايا عند الموت. بمجرد إصلاحها ، يتم وضع العينات في وسيط تضمين قادر على دعم العينة بشكل كافٍ.الأكثر شيوعًا هو شمع البارافين ، ولكن يتم أيضًا استخدام مواد أخرى مثل وسط التجميد القائم على الجلسرين والأجار لإحاطة العينة أثناء التقسيم. يتم بعد ذلك التقسيم على مشراح أو أي جهاز قطع آخر يسمح للمستخدم بحلق العينة إلى شرائح رفيعة تتراوح من بضعة ميكرونات إلى بضعة ملليمترات في السماكة. بمجرد القطع ، يتم تثبيت المقاطع على شريحة زجاجية وملطخة لإبراز ميزات معينة للعينة قبل تصويرها بالمجهر.

    إجراء

    علم الأنسجة هو مصطلح يشير إلى دراسة التشريح المجهري للأنسجة والخلايا. يعد التحضير المناسب للعينة النسيجية للفحص المجهري الضوئي ضروريًا للحصول على نتائج الجودة من عينات الأنسجة.

    هناك ثلاث خطوات رئيسية مشتركة في جميع الإجراءات النسيجية تقريبًا. أولاً ، يتم إصلاح العينة من أجل الحفاظ على الأنسجة وإبطاء تدهور الأنسجة. بعد ذلك ، يتم غمر العينة في مادة ، أو وسائط مدمجة ، لها خواص ميكانيكية مماثلة لها. بمجرد دمج العينة ، يتم تقسيمها أو تقطيعها إلى شرائح رقيقة باستخدام أداة قطع دقيقة تعرف باسم مبضع. يصف هذا الفيديو هذه الخطوات العامة وبعض المفاهيم التي تتعلق بها.

    يعد تثبيت الأنسجة خطوة حاسمة للحفاظ على مكونات الخلايا والأنسجة والحفاظ على بنيتها. بعد موت الخلية ، يتم إطلاق الإنزيمات التي تحدث بشكل طبيعي من العضيات الخلوية وتبدأ في تحلل البروتينات في جميع أنحاء الخلية والمصفوفة خارج الخلية ، وبالتالي تدمير بنية الخلية. يمنع التثبيت مثل هذا التدهور عن طريق تثبيط قدرة هذه الإنزيمات على هضم البروتين بشكل مباشر وعن طريق جعل مواقع انقسام الإنزيم غير معروفة.

    آليتان رئيسيتان للتثبيت هما الترابط المتقاطع والتخثر. يتضمن الارتباط المتقاطع تكوين الرابطة التساهمية داخل البروتينات وفيما بينها ، مما يتسبب في تصلب الأنسجة وبالتالي مقاومة التدهور. يحدث التخثر بسبب جفاف البروتينات من خلال استخدام الكحوليات أو الأسيتون ، مما يؤدي إلى تشويه بنية البروتين الثلاثية ، بحيث تحرك المناطق الكارهة للماء ، أو التي تخشى الماء ، سطح البروتين. يمكن أن يساعد التثبيت التخثرى فى ترسيخ الوسائط ، مثل شمع البارافين ، على اختراق الأنسجة.

    أحد أكثر المثبتات شيوعًا هو الفورمالين ، وهو الفورمالديهايد المذاب في الماء. أثناء التثبيت ، يرتبط الفورمالديهايد بالأمينات الأولية ، مثل تلك الموجودة على السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية ليسين والجلوتامين لتشكيل ارتباط متشابك ثابت يسمى جسر الميثيلين. هذه العملية بطيئة بطبيعتها ويمكن أن تستغرق ما يصل إلى يوم أو يومين.

    قبل التثبيت يجب وضع بعض الاعتبارات. أولاً ، ضع في اعتبارك مدى انتشار العينة. ستنتشر المثبتات مسافة عبر الأنسجة بمعدل متعلق بمعامل الانتشار للمثبت مضروبًا في الجذر التربيعي للوقت. يستغرق المثبت الذي يستغرق ساعة ليخترق 1 ملم في العينة 25 ساعة ليخترق 5 ملم. بمجرد وصول الفورمالين إلى مركز الأنسجة ، يجب أن يحدث عتبة تفاعل التشابك. وبالتالي ، يجب أن يكون حجم العينة محددًا بسمك 4 مم للتثبيت الدقيق في فترة زمنية معقولة.

    ثانيًا ، ضع في اعتبارك حجم ودرجة الحموضة للمثبت. يجب أن تكون نسبة التثبيت إلى حجم العينة 40: 1 على الأقل حتى لا ينضب الكاشف بسهولة بمرور الوقت. في حين أن بعض المثبتات مصممة للعمل عند درجة حموضة حمضية ، فإن الفورمالين يعمل بشكل أفضل عندما يتم تخزينه بالفوسفات للحفاظ على الرقم الهيدروجيني المحايد ، بحيث لا يتم إنتاج الحمض الزائد ، مما يتسبب في حدوث آثار في الأنسجة.

    الخطوة التالية في التحضير النسيجي هي التضمين ، والذي يتضمن دعم العينات في الوسائط التي لها صلابة ميكانيكية مماثلة للعينة نفسها. يعد اختيار وسيط التضمين الصحيح أمرًا بالغ الأهمية ، لأنه إذا كان شديد الصلابة أو ضعيفًا جدًا ، فقد تحدث عيوب أثناء التقسيم. إلى حد بعيد ، فإن أكثر الوسائط المستخدمة للتضمين شيوعًا هي شمع البارافين.

    قبل إدخال البارافين ، يجب تجفيف العينات عن طريق استبدال الماء الموجود في الأنسجة بالإيثانول ، أولاً ، يليه الزايلين ، ثم شمع البارافين الدافئ أخيرًا. بمجرد تسلل الشمع إلى العينة ، يتم وضعه بعناية وإحاطة الشمع الإضافي باستخدام قالب لتشكيل كتلة. بعد ذلك ، يتم إرفاق العينات بشريط مناديل لتقسيمها.

    التقسيم هو عملية قطع شرائح رقيقة من عينة من كتلة التضمين. عادة ما تكون المقاطع بترتيب من 4-10 & # 181 م سميكة للاستخدام مع الفحص المجهري الضوئي.

    لقطع المقاطع ، يتم أولاً تأمين شفرة معدنية أو زجاجية أو ماسية على مشراح. ثم توضع العينة في حامل العينة. بعد ذلك ، يتم دفع العينة إلى سطح القطع وسحبها عبر الشفرة لإنشاء شريحة بالسماكة المطلوبة. سوف تتجمع الأقسام كأشرطة رفيعة يمكن وضعها على الشرائح الزجاجية.

    بعد باجتزاء ، يتم وضع العينات على الشرائح. بالنسبة لعينات البارافين المضمنة ، توضع الشرائح أولاً في حمام مائي دافئ ثم تُرفع من الماء على الشريحة وتُترك لتجف.

    تحتوي الأنسجة البيولوجية على تباين متأصل ضئيل جدًا ، لذلك بعد الأنسجة ، عادةً ما تكون الشرائح ملطخة بأصباغ أو أجسام مضادة تسلط الضوء على التشكل أو بروتينات معينة. البقع الأكثر شيوعًا التي يتم إجراؤها هي الهيماتوكسيلين والأيوزين ، أو H & ampE. نظرًا لأنه شائع جدًا ، فقد تم تصنيع العديد من الآلات الآلية لتكرار تلطيخ العديد من الأقسام باستخدام H & ampE. يصبغ الهيماتوكسيلين نوى الخلايا باللون الأزرق ويوزين يلطخ السيتوبلازم الوردي ليكشف عن التشكل الخلوي للأنسجة.

    أحد عيوب التثبيت هو أن الارتباط المتبادل للبروتينات يمكن أن يجعل الأمر أكثر لتسمية الأجسام المضادة للعثور على مواقع الارتباط الخاصة بها. بدلاً من استخدام التثبيت للاحتفاظ بالعينات ، يمكن استخدام التجميد السريع للأنسجة أو التجميد المفاجئ ، والذي يتبعه تقنية التقسيم تسمى التقطيع بالتبريد

    يتم دمج عينات الأنسجة وتوجيهها في وسط تجميد خاص يسمى OCT ، أو وسط درجة حرارة القطع الأمثل ثم يتم تجميدها بسرعة. مثل وسائط التضمين الأخرى ، يطابق OCT صلابة العينة.

    يستخدم جهاز cryomicrotome أو cryostat لقطع المقاطع المجمدة ويحافظ هذا الجهاز على درجة حرارة داخلية تبلغ -20 درجة مئوية للحفاظ على شفرة القطع والعينات باردة. على عكس المقاطع المضمنة بالبارافين ، يمكن رفع المقاطع المجمدة مباشرة على شريحة زجاجية موجبة الشحنة مباشرة بعد التقسيم.

    طريقة أخرى لتجنب التثبيت هي عن طريق تضمين أجار ، حيث يتم تغطية العينات بسائل الاغاروز الطازج. عندما يبرد الاغاروز ، فإنه يحبس الأنسجة في مكانها ويمكن التخلص من الاغاروز الزائد.

    تحتوي Vibrotomes ، وهي بديل آخر للمرحاض ، على شفرة تهتز وتتحرك عبر العينة المضمنة في agarose. تُستخدم Vibrotomes لإنشاء أقسام سميكة بترتيب 50-1000 & # 181m من عينات agarose المدمجة.

    يتم عادةً إزالة العينات من agarose قبل التلوين ، ثم يتم وضعها على شريحة محاطة بمادة مثل شحم الفراغ الذي يمنع الغطاء من سحق العينة. من الأفضل عرضها باستخدام الفحص المجهري (كنفوكل) من أجل الحصول على صور عالية الدقة لكل قسم سميك.

    لقد شاهدت للتو فيديو JoVE & rsquos حول تحضير العينة النسيجية للفحص المجهري الضوئي.

    يجب أن تفهم الآن الخطوات المتضمنة لتحضير العينة لتنتقل من قطعة منديل إلى قسم قابل للتلطيخ. كما هو الحال دائما، وذلك بفضل لمشاهدة!


    طريقتان لتأسيس خلايا انسجة بطانة الرحم البشرية الأولية من عينات استئصال الرحم

    يعد إنشاء أنظمة زراعة خلايا انسجة بطانة الرحم الأولية من عينات استئصال الرحم تقنية بيولوجية قيمة وخطوة حاسمة قبل متابعة مجموعة واسعة من أهداف البحث. هنا ، نصف طريقتين مستخدمتين لإنشاء مزارع انسجة من أنسجة بطانة الرحم التي تم استئصالها جراحيًا لمرضى من البشر. & # 160

    الملخص

    تم تكريس العديد من الجهود لإنشاء في المختبر أنظمة زراعة الخلايا. تم تصميم هذه الأنظمة لنمذجة عدد كبير من في الجسم الحي العمليات. أنظمة زراعة الخلايا الناشئة عن عينات بطانة الرحم البشرية ليست استثناء. تتراوح التطبيقات من العمليات الفسيولوجية الدورية العادية إلى أمراض بطانة الرحم مثل السرطانات النسائية والأمراض المعدية وأوجه القصور الإنجابية. هنا ، نقدم طريقتين لإنشاء خلايا انسجة بطانة الرحم الأولية من عينات استئصال الرحم التي تم استئصالها جراحيًا. يشار إلى الطريقة الأولى بـ & # 8220 طريقة القشط & # 8221 وتتضمن الكشط الميكانيكي باستخدام الشفرات الجراحية أو الشفرات بينما الطريقة الثانية تسمى & # 8220 طريقة التربسين. & # 8221 تستخدم هذه الطريقة الأخيرة النشاط الأنزيمي للتربسين لتعزيز فصل الخلايا ونمو الخلايا الأولية. نوضح منهجية خطوة بخطوة من خلال الصور الرقمية والفحص المجهري. نقدم أيضًا أمثلة للتحقق من صحة خطوط خلايا انسجة بطانة الرحم عبر تفاعلات سلسلة البلمرة الكمية في الوقت الحقيقي (qPCR) والتألق المناعي (IF).

    مقدمة

    يتكون جسم الرحم البشري من ثلاث طبقات ، المحيط (أو المصل) ، وعضل الرحم ، وبطانة الرحم. يعد تمييز كل طبقة من هذه الطبقات خطوة مهمة لإنشاء خطوط خلايا بطانة الرحم. الطبقة المحيطة بالرحم هي الطبقة الخارجية للرحم وتتكون من خلايا مصلية رفيعة. عضل الرحم هو الطبقة الوسطى السميكة للرحم ويتكون من خلايا عضلية ملساء. يتم تحديد بطانة الرحم على أنها الطبقة الداخلية للرحم وتشمل مجموعات الخلايا الظهارية والسدوية.

    تنقسم بطانة الرحم إلى الطبقة القاعدية التي يُفترض أن سكان الخلايا الجذعية يعيدون ملء الطبقة الوظيفية كل 28 يومًا تقريبًا # 160 1. تخضع الطبقة الوظيفية لبطانة الرحم البشرية لتغيرات بيوكيميائية ومورفولوجية كبيرة استجابةً للهرمونات المنتشرة. هذه الهرمونات مشتقة من الغدة النخامية والمبايض.

    ينتج عن الإنتاج والإفراز المنسق للهرمونات دورة تناسلية. تم تصميم الدورة التناسلية لتحضير بطانة الرحم لأحداث زرع الجنين المحتملة. تُعرف الدورة التناسلية عند البشر بـ & # 8220 الدورة الشهرية & # 8221 وتنقسم إلى ثلاث مراحل & # 8211 التكاثري ، والإفرازي ، والحيض. تتضمن المرحلة التكاثرية تكاثر طبقة بطانة الرحم الوظيفية بينما تتميز المرحلة الإفرازية بالنضج الوظيفي. على وجه التحديد ، تشير التعديلات والإفرازات والتمايز الخلوي خارج الخلية إلى انغراس محتمل. إذا لم يحدث الانغراس قبل نهاية المرحلة الإفرازية ، فإن طبقة بطانة الرحم الوظيفية تتساقط خلال مرحلة الحيض. لا تزال أهمية الدورة الشهرية والأحداث التي تؤدي إلى تساقط الطبقة الوظيفية قيد المناقشة. في البشر ، تم الافتراض أن الحيض هو نتيجة حدث تمايز طور إفرازي متوسط ​​معروف باسم & # 8220 spontaneous decidualization & # 8221 & # 160 2. في هذه المخطوطة ، نقدم منهجية مفصلة لكل من طرق عزل خلايا انسجة بطانة الرحم ، واستخدام مزيج من التألق المناعي والصور الرقمية لإثبات فعالية هذه الأساليب. بالإضافة إلى ذلك ، نقوم بتطبيق في المختبر نموذج من التساقط العفوي لتأكيد عزل خلايا انسجة بطانة الرحم.

    الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

    بروتوكول

    تم جمع عينات استئصال الرحم المستخدمة في هذه المخطوطة وفقًا لبروتوكول الأخلاقيات المعتمد من جامعة IRB والمرقّم IRB-HSR # 14424.

    1. اقتناء عينة من المصدر السريري

    1. الحصول على المبادئ التوجيهية الأخلاقية على مستوى الحكومة والمؤسسات ووثائق الموافقة قبل البدء.
    2. إجراء جميع الخطوات في ظروف معقمة.
    3. الحفاظ على الأنسجة المشتقة من المريض في وسط (RPMI أو DMEM / High Glucose) في أنبوب 50 مل عند 4 & # 176 درجة مئوية إذا كان لا يمكن معالجة العينة في المزرعة على الفور. يمكن تخزين العينات في هذه الحالة لمدة أقصاها 24 ساعة.
    4. اغسل عينة الأنسجة ثلاث مرات باستخدام محلول ملحي معقم 1X (PBS) وتجاهل المحلول بين الغسلات.

    2. إعداد خطوط الخلايا الأولية باستخدام طريقة القشط

    1. أضف 4-10 مل من وسط النمو (RPMI أو DMEM / الجلوكوز المرتفع المضاف إليه 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بنسلين ستربتومايسين) إلى الأنسجة وأضف Fungizone (0.25 & # 181 جم / مل التركيز النهائي) لمدة 30 دقيقة.
    2. تجاهل وسائط النمو.
    3. غسل الأنسجة مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X.
    4. ضع الأنسجة على لوحة زراعة خلية 6 سم للتمييز بين طبقات عضل الرحم وبطانة الرحم (راجع الأشكال 2A-2C لمزيد من الوصف). افصل بطانة الرحم.
    5. باستخدام مشرط أو شفرة حلاقة ، قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة أثناء خدش طبق زراعة الخلية 6 سم. تسهل هذه الخدوش التعلق بخلايا بطانة الرحم الأولية الناشئة. بالمقارنة مع طريقة التربسين ، هناك حاجة إلى مزيد من الأنسجة (انظر الشكل 2 د لتقريب).
    6. برفق ، أضف 2 مل من وسائط النمو إلى الطبق المخدوش (ستكون شظايا الأنسجة مرئية ومثبتة بشكل مثالي من حركة الخدش).
    7. نقل اللوحة (اللوحات) إلى حاضنة ثقافة الخلية المعينة (37 & # 176C و 5٪ CO2). قم بتعيين مكان لخطوط الخلايا الأولية ، بعيدًا عن أطباق زراعة الخلايا الأخرى. الثقافات الأولية أكثر حساسية للعدوى والتلوث.
    8. افحص الخلايا تحت المجهر الضوئي يوميًا. يجب أن تظهر مجموعات صغيرة من الخلايا بحلول اليوم الثاني أو الثالث من الأنسجة المقطعة (انظر الشكل 3 ب).
    9. للحفاظ على الثقافات ، اغسل برفق باستخدام 1X PBS وأضف وسط نمو جديد (2 مل) كل ثلاثة أيام. عندما يزيد معدل التكاثر ، يمكن إضافة وسائط نمو إضافية (3-4 مل) إلى لوحة (ألواح) الثقافة 6 سم.
      ملاحظة: أثناء الغسيل وتغيير الوسائط ، من المحتمل أن يتم استنشاق قطع من الأنسجة. هذا لن يؤثر على نمو الخلايا الملتصقة. يجب استنشاق قطع الأنسجة في الخطوة التالية (2.10) حيث من غير المحتمل ظهور مستعمرات جديدة بعد أسبوع واحد.
    10. عندما تكون اللوحة مقاس 6 سم متكدسة تقريبًا 75-80٪ (انظر الشكل 3 ب)، تمرير باستخدام التربسين 0.05٪. لا يمكن تمرير الخلايا الأولية إلى أجل غير مسمى - قم بتجميد صفيحة واحدة من الخلايا بمجرد الحفاظ على صفيحتين أو ثلاث. إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من الممرات ، فاتبع بروتوكول الخلود (تمت مراجعته في المرجع 3).

    3. إعداد خطوط الخلايا الأولية باستخدام طريقة التربسين

    1. ضع قطعة صغيرة من نسيج بطانة الرحم (انظر الشكل 2 د لتقريب) في 2 مل من 0.25٪ التربسين مع كاناميسين (0.03 ملغ / مل التركيز النهائي).
    2. احتضان الأنسجة عند 37 & # 176 درجة مئوية على منصة دوارة لمدة 30 دقيقة.
    3. لفترة وجيزة دوامة الأنسجة.
    4. الطرد المركزي العينة في 200-400 x g لمدة 2 دقيقة & # 160 وتجاهل المادة طافية.
    5. أضف التربسين الطازج والكاناميسين.
    6. احتضان الأنسجة عند 37 & # 176 درجة مئوية أثناء الدوران لمدة ساعة.
    7. دوامة الأنسجة لمدة 5-10 ثانية.
    8. أضف 2 مل من وسط النمو (مكمل بـ 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بنسلين ستربتومايسين) لإلغاء تنشيط التربسين.
    9. خلايا الطرد المركزي 200-400 x g لمدة 2-3 دقائق.
    10. تجاهل المادة طافية وإضافة 2 مل من وسائط النمو إلى الخلايا الحبيبية.
    11. لوحة على طبق ثقافة الخلية 6 سم. كشط اللوحة كما في الخطوة 2.5 من تحضير خطوط الخلايا الأولية باستخدام طريقة الكشط ليس ضروريًا ، ولكنه يعزز الارتباط ونمو الثقافات الأولية.
    12. مراقبة الخلايا تحت المجهر الضوئي يوميًا. عادة ما تكون الخلايا مرئية تحت المجهر الضوئي بعد 24-48 ساعة و # 160(انظر الشكل 3 ج).
    13. للحفاظ على الثقافات ، قم بمراقبة الخلايا وتغيير الوسائط كل 2-3 أيام كما في الخطوة 2.9.
    14. لتمرير الخلايا ، استخدم التربسين 0.05٪ أو 0.25٪ عندما تصل الخلايا إلى 75-80٪ التقاء (انظر الشكل 3 ج).

    4. حفظ الأنسجة الزائدة للتحليل (التجميد المفاجئ وتثبيت الفورمالين)

    1. اغسل العينة مرتين مع 1X PBS.
    2. نضح أكبر قدر ممكن من السائل.
    3. للتجميد المفاجئ ، ضع عينة نسيج بطانة الرحم في أنبوب طرد مركزي 1.7 (انظر الشكلين 2F و 2G). ضع أنبوب الطرد المركزي 1.7 في النيتروجين السائل لمدة 10 ثوانٍ و # 160 أو حتى يمكن ملاحظة أن الأنسجة قد تجمدت.
      ملاحظة: احرص على عدم لمس النيتروجين السائل مباشرة عند تحضير العينات. يمكن تخزين العينات في -80 & # 176 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة أو التحليل.
    4. لتثبيت الفورمالين ، قطع قطعة صغيرة من نسيج بطانة الرحم (انظر الشكل 2 ح)، واغمره في 10٪ من الفورمالين الزنك المخزن. بعد 24 ساعة ، تخلص من الفورمالين وأضف 70٪ من الإيثانول إلى عينات الأنسجة حتى مزيد من المعالجة.
    1. تثبيت الخلية
      1. تحضير الخلايا على شريحة أو لوحة الثقافة.
      2. بلطف ، اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني 1X.
      3. أضف الميثانول والأسيتون المبرد مسبقًا (4 & # 176 درجة مئوية) (مخلوط بنسبة 1: 1) لمدة 5 دقائق.
      4. جفف الشريحة بالهواء قبل المتابعة. يمكن تخزين الشريحة في 4 & # 176C لمدة 1-2 أسابيع إذا لزم الأمر.
      1. ترطيب الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقائق. للخطوات التالية من 1 إلى 6 ، قم بإجراء جميع عمليات الغسيل والحضانة على منصة دوارة.
      2. منع باستخدام 1X PBS مكمل بـ 1٪ من الألبومين المصل البقري (BSA) و 1٪ مصل خاص بالأنواع (مصدر ثاني جسم مضاد) لمدة 30 دقيقة و 160 درجة في درجة حرارة الغرفة (RT).
      3. احتضان الجسم المضاد الأولي (انظر توصيات الشركات المصنعة لتخفيف الأجسام المضادة). تشير إلى المواد لأجسام مضادة معينة. تمييع الجسم المضاد الأولي في المخزن المؤقت للحظر الجديد كما في الخطوة 5.2.2. يمكن إجراء هذه الحضانة لمدة ساعتين على الأقل & # 160 في RT أو بين عشية وضحاها في 4 & # 176 درجة مئوية.
      4. اغسل 3 مرات مع 1X PBS لمدة 5 دقائق و # 160 كلش.
      5. احتضان في الأجسام المضادة الثانوية (انظر توصيات الشركات المصنعة لتخفيف الأجسام المضادة). تمييع الجسم المضاد الثانوي في المخزن المؤقت للحظر الجديد كما في الخطوة 5.2.2. لمنع التبييض الضوئي ، من المهم إجراء هذه الخطوات والخطوات اللاحقة في غياب الضوء.
      6. اغسل 3 مرات مع 1X PBS لمدة 5 دقائق و # 160 كلش.
      7. جفف الشرائح تمامًا.
      8. أضف وسائط التركيب وحل DAPI المضاد.
      9. ضع غطاء وأغلق الحواف باستخدام مانع التسرب. يمكن تخزين الشرائح في 4 & # 176 درجة مئوية في الظلام لمدة تصل إلى أسبوعين.
      1. بيليه 1 × 10 7 خلايا بالطرد المركزي. يجب أن تكون جميع المواد والكواشف في هذا البروتوكول خالية من RNAse.
      2. خلايا ليس في 1 مل من كاشف تريزول ، واحتضان العينات المتجانسة لمدة 10 دقائق و 160 درجة في درجة حرارة الغرفة لإكمال تفكك مجمعات البروتين النووي.
      3. أضف 200 & # 181 لتر من الكلوروفورم لكل 1 مل من تريزول. رج بقوة باليد لمدة 15 ثانية رقم 160 واحتضانها لمدة 2-3 دقائق و 160 درجة مئوية.
      4. جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة (15000 × جم) لمدة 15 دقيقة & # 160 في 4 & # 176 درجة مئوية. ستنتج ثلاث طبقات.
      5. نقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديد. أضف 1 & # 181l جليكوجين لزيادة إنتاج الحمض النووي الريبي ، ومع ذلك ، فإن هذه الخطوة ضرورية فقط عند توقع كمية صغيرة من الحمض النووي الريبي.
      6. أضف 0.5 مل من كحول الأيزوبروبيل إلى الطبقة المائية ، وعكس العينات 3-5 مرات. احتضان العينات في الرايت لمدة 10 دقائق. لزيادة الإنتاجية ، يمكن وضع العينات في -20 & # 176C أو -80 & # 176C لمدة 30 دقيقة.
      7. جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق & # 160 في 4 & # 176 درجة مئوية.
      8. في هذه المرحلة ، يجب أن تكون حبيبة صغيرة من الحمض النووي الريبي مرئية. تجاهل المادة طافية.
      9. اغسل الحمض النووي الريبي مع 1 مل من الإيثانول 75٪.
      10. الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 5 دقائق # 160 وتجاهل المادة الطافية. يمكن غسل العينات مرة أخرى للتخلص من الملوثات غير العضوية ، ولكن هذه الخطوة غير ضرورية.
      11. لفترة وجيزة ، جفف بيليه الحمض النووي الريبي حتى تجف حبيبات الحمض النووي الريبي (عادة ما يستغرق 7-10 دقائق).
        ملاحظة: يمكن استخدام خطوة إضافية لتقليل المواد غير العضوية وتقليل وقت التجفيف. بعد التخلص من المادة الطافية من غسل الإيثانول ، تدور عينات بأقصى سرعة لمدة دقيقة إضافية ونضح السائل المتبقي. احرص على عدم نضح الحبيبات.
      12. حل الحمض النووي الريبي في الماء الخالي من الحمض النووي الريبي ، اعتمادًا على حجم بيليه الحمض النووي الريبي. تتراوح الأحجام عادة من 10-50 & # 181 لتر.
      13. احتضان العينات في 55 & # 176C لمدة 10 دقائق ، وقياس تركيز الحمض النووي الريبي.
      14. تخزين العينات في -20 & # 176 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
      1. أحضر عينة RNA (1-3 & # 181 جم) إلى حجم 9 & # 181 لتر مع H.2س.
      2. تسخين RNA إلى 70 & # 176 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      3. لتوليد مزيج رئيسي من AMV ، اجمع الكواشف التالية: 5 & # 181l من dNTP (تركيز العمل 50 & # 181M) ، 5 & # 181l من N6 DNA oligos (تركيز العمل 80 & # 181M) ، 5 & # 181 لتر من 5X AMV عازلة ، و 1 & # 181 لتر من AMV. تم تصميم حل المزيج الرئيسي هذا لكل عينة واحدة.
      4. أضف 16 & # 181 لترًا من المزيج الرئيسي إلى الحمض النووي الريبي الساخن. سيكون حجم التفاعل النهائي 25 & # 181 لترًا من التفاعل.
      5. استخدم شروط PCR التالية للنسخ العكسي: (المرحلة 1) 42 & # 176C لمدة 90 دقيقة ، (المرحلة 2) 95 & # 176C لمدة 5 دقائق ، و (المرحلة 3) 4 & # 176C حتى مزيد من المعالجة.
      1. قم بإجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات ودرجات حرارة التلدين وأرقام الدورات والكواشف الموجودة في الجدول 1.
        ملاحظة: من المثالي اتباع تعليمات الشركة المصنعة عند استخدام كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (راجع أرقام الشركة والكتالوج بتنسيق المواد).

      9. في المختبر بروتوكول Decidualization (مشتق من المرجع 4 و 5)

      1. خلايا بطانة الرحم.
      2. تنمو لتجمع 75-85٪.
      3. بعد أن تصبح الخلايا متكدسة ، اغسلها مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني واحد.
      4. بسرعة ، أضف وسائط خالية من الهرمونات (RPMI خالية من الفينول مكملة بشريط فحم بنسبة 5٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين).
      5. بعد 24 ساعة ، أضف وسائط خالية من الهرمونات مكملة بميدروكسي بروجستيرون أسيتات (MPA) بتركيز نهائي قدره 1 & # 181 م و 8 برومودينوسين 3 & # 39،5 & # 39-فوسفات دوري (cAMP) بتركيز نهائي قدره 0.5 ملي مولار.
      6. بعد 48 ساعة على الأقل ، أوقف التفاعل واحفظ اللوحة (الألواح) لمزيد من المعالجة.

      الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

      نتائج الممثل

      كما أكد في بروتوكول ، تأكد من إجراء جميع الأساليب وفقًا للمبادئ التوجيهية الحكومية والمؤسسية والأخلاقية عند التعامل مع الأنسجة البشرية وإعدادها.

      تشتمل هذه المخطوطة على توضيح لسير العمل العام لـ "طريقة الكشط" (الشكل 1 أ) و "طريقة التربسين" (الشكل 1 ب) المستخدمة لتأسيس مزارع بطانة الرحم الأولية. يتم وصف هذه الطرق بالتفصيل في بروتوكول (انظر الأجزاء # 1601. - 3.). أثبتت كلتا الطريقتين نجاحهما في نمو ثقافات بطانة الرحم الأولية. ميزة "طريقة الكشط" هي تقصير وقت التحضير ، ومع ذلك ، فإن الوقت الذي تستغرقه مراقبة الخلايا القابلة للحياة يكون عادة 2-4 مرات أطول مقارنة بـ "طريقة التربسين".

      يتم توفير صور رقمية للأنسجة البشرية الأولية التي تم استلامها من شراء الأنسجة. يمكن تمييز طبقات الرحم بخشونة الطبقة ، بمعنى آخر. عضل الرحم سميك وعضلي وبطانة الرحم رقيقة وأكثر غلة. لقد أبرزنا طبقة العضلات السميكة والملساء (عضل الرحم) باللون الأبيض وحددنا طبقة بطانة الرحم ذات الأهمية باللون الأسود من عينتين مختلفتين لاستئصال الرحم (الشكلان 2 أ و 2 ب). في الشكل 2 ج، يتم توجيه الأنسجة بحيث يكون عضل الرحم متجهًا لأعلى بينما يتم وضع بطانة الرحم لأسفل. تم استئصال الطبقة الرقيقة المحيطة بالجراحة ولم يتم إبرازها في هذه الصور. من المهم أيضًا ملاحظة أن حجم طبقة بطانة الرحم في هذه الصور الرقمية ثنائية الأبعاد غير صحيح نظرًا لأن الطبقة الفعلية ثلاثية الأبعاد رقيقة جدًا مقارنةً بعضل الرحم.

      يعد قص الحجم المناسب للنسيج أمرًا مهمًا لكل من "طريقة القشط" و "طريقة التربسين". في الشكل 2 د، يتم تحديد الأحجام المناسبة لكل طريقة فوق العينة المعنية. استخدام قطعة واحدة مقاس 0.5x0.5x0.5 سم لـ "طريقة التربسين" [يسار] كافٍ لتأسيس ثقافة. يشمل نسيج البدء التمثيلي لـ "طريقة الكشط" [يمين] جميع طبقات الرحم. يتم تمثيل المنتج النهائي لـ "طريقة الكشط" في الشكل 2E، ويوصى باستخدام أنسجة بطانة الرحم بحجم 1 × 1 × 1 سم على الأقل لإنشاء مزارع قابلة للحياة. شرط الحصول على هذا القدر من الأنسجة هو عيب في "طريقة القشط".

      غالبًا ما يتم استخدام الأنسجة المتبقية بعدة طرق بما في ذلك تحليلات البروتين والحمض النووي الريبي. لضمان الحفاظ على جودة الأنسجة ، من المهم استخدام طريقة "التجميد المفاجئ" كما في بروتوكول قسم (انظر 4.). هذه الطريقة موضحة أيضًا في الشكل 2 و و الشكل 2G. الحفاظ على الأنسجة الزائدة عن طريق تثبيت الفورمالين هو أيضًا ممارسة شائعة لأخصائيي علم الأمراض والباحثين. تحضير الأنسجة لتثبيت الفورمالين موصوف في بروتوكول قسم (انظر 4.) ويتضح في الشكل 2 ح.

      الفحص المجهري الضوئي ضروري لرصد ثقافات بطانة الرحم الأولية. يجب أن تظهر خلايا انسجة بطانة الرحم الفردية مورفولوجيا الخلايا الليفية (الشكل 3 أ). عادة ما تولد "طريقة الكشط" مجموعات من الخلايا الناشئة المبكرة ، بشكل أساسي على طول الخدوش التي يسببها المشرط (الشكل 3 ب، اليوم الثاني). تولد "طريقة التربسين" أنماط نمو الخلايا العنقودية والمشتتة (الشكل 3 ج، اليوم الرابع). لقد قمنا بتضمين العديد من الصور التمثيلية من الطلاء الأولي (اليوم 0) إلى المقطع الأول لكل طريقة (الشكل 3 ب و 3 ج).

      يتم تحديد العديد من الأنسجة من خلال تعبيرها عن علامات خاصة بالأنسجة مثل أكتين العضلات الملساء (SMA) للعضلات الملساء ، و CD34 للخلايا الجذعية المناعية ، وما إلى ذلك. بينما تم إجراء تجارب التعبير الجيني والبروتيني لبطانة الرحم & # 160 6-11 ، لم يتم اكتشاف علامة محددة لخلية انسجة بطانة الرحم. بدلاً من ذلك ، يقوم الباحثون عادةً بتقييم نقاء سدى بطانة الرحم عن طريق قياس العلامات من ملوثات الخلايا المحتملة. على سبيل المثال ، تُستخدم علامات السيتوكيراتين لإظهار التجمعات الظهارية. ومع ذلك ، فهي أقل إثارة للقلق ، لأن إنشاء والحفاظ على ظهارة بطانة الرحم أمر صعب وعادة ما يتم اختياره ضد (المرجع 12 و الشكل 4 أ). إذا تم الحصول على عينات أثناء الحمل ، فإن التعبير الإيجابي عن HLA-A ، -B ، -C يوضح الخلايا الجرثومية وخلايا الأرومة الغاذية # 160 13. من ناحية أخرى ، مثل الخلايا الليفية اللحمية الأخرى ، تعبر خلايا انسجة بطانة الرحم عن فيمنتين (CDH1). نظهر مع التألق المناعي ، والتعبير عن الفيمنتين وغياب السيتوكيراتين و E cadherin (CDH1) في خلايا انسجة بطانة الرحم لدينا (الشكل 4 ب).

      أخيرًا ، نقدم دليلًا وظيفيًا على ثقافة بطانة الرحم الأولية عبر في المختبر مقايسة decidualization العفوية. تم تكييف هذه الطريقة من المرجع 4 & # 160 و 5 ، وتتضمن معالجة الثقافات بمزيج من Medroxyprogesterone acetate (MPA) و 8-bromoadenosine 3 & # 8217،5 & # 8217-cyclic monophosphate (cAMP) (موصوف في 9. في المختبر بروتوكول Decidualization ونمذجة في الشكل 5 أ). في وجود MPA و cAMP ، تُظهر خلايا انسجة بطانة الرحم ملامح تعبير جيني متغيرة بشكل كبير (تمت مراجعتها في المرجع & # 160 14). علامات فك الشفرة التلقائية التي يتم نشرها بشكل متكرر هي البرولاكتين (PRL) و بروتين ملزم لعامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 (IGFBP1) (تمت المراجعة في المرجع 14). تعتبر استجابة هذين الجينين لـ MPA و cAMP مؤشرات قوية على كل من التقسيم التلقائي والتأسيس الناجح لثقافة انسجة بطانة الرحم. نظهر هذا في الشكل 5 ب.


      الشكل 1. رسم تخطيطي لطريقتين أساسيتين لعزل بطانة الرحم. (أ) يتم عرض الخطوات 2.1-2.10 من طريقة الكشط في مخطط هيكلي. (ب) يتم عرض الخطوات 3.1-3.14 لطريقة التربسين في مخطط هيكلي. انقر هنا لمشاهدة صورة أكبر.


      الشكل 2. معالجة أنسجة الرحم. (أ-ج) عينات الرحم السريرية من مريضتين. أ & # 38 ج مشتقة من المريض 1 و ب مشتق من المريض 2. أنسجة الرحم المستأصلة جراحيًا (اليسار) وطبقات الرحم المميزة (حق). (أ & # 38 ب) عضل الرحم محاطة بدائرة بيضاء وبطانة الرحم باللون الأسود. (ج) عضل الرحم يواجه الكاميرا. (د) يشار إلى أحجام عينات بطانة الرحم التمثيلية الأولية لكلا طريقتي العزل. تتطلب طريقة التربسين بطانة الرحم النقية قبل إضافة التربسين بينما طريقة الكشط يمكن أن تستخدم عينات الرحم بأكملها. (هـ) مثال على عينة بطانة الرحم المعالجة لطريقة الكشط. (F & # 38 G) صورة لأنسجة الرحم المتبقية قيد التحضير للتجميد المفاجئ. الظاهر عبارة عن حاوية معدنية مصنوعة في المختبر مستخدمة لهذه الطريقة. (ح) تثبيت الفورمالين لعينة بطانة الرحم. انقر هنا لمشاهدة صورة أكبر.


      الشكل 3. صور مجهرية ضوئية من ثقافات بطانة الرحم الأولية. (أ) صور تمثيلية لثقافات الخلايا انسجة بطانة الرحم التي اتخذت في مختلف القوى والتقاء. (ب) صور تمثيلية لطريقة القشط (أيام 0 - 16) مأخوذة من نفس طبق الثقافة ، تعمل بالطاقة في 10x. ملحوظة: تشير الخطوط المرئية إلى وجود خدوش من شفرة جراحية. (ج) صور تمثيلية لطريقة التربسين (أيام 0-16) مأخوذة من نفس طبق الثقافة ، تعمل بالطاقة في 10x. انقر هنا لمشاهدة صورة أكبر.


      الشكل 4. صور التألق المناعي لخلايا انسجة بطانة الرحم. (أ) التألق المناعي لمزارع بطانة الرحم الأولية المعزولة بطريقة الكشط. توضح الصور فقدان السيتوكيراتين بين المرور 2 (P2) والممر 5 (P5). تم استخدام البروتين النووي لبروتين اللوكيميا (PML) وتلطيخ DAPI كعناصر تحكم. (ب) تظهر الصور تلطيخًا إيجابيًا لعلامة اللحمة المتوسطة فيمنتين. تظهر الصور أيضًا تلطيخًا سلبيًا لـ E cadherin (CDH1) و Cytokeratin. تم توفير تلطيخ DAPI وبروتين سرطان الدم البروميلوسيتي (PML) كعناصر تحكم. انقر هنا لمشاهدة صورة أكبر.


      الشكل 5. decidualization العفوي لاثنين من الخلايا اللحمية الأولية بطانة الرحم. (أ) الخطوط العريضة للإجراء التجريبي. (ب) تنظيم التعبير الجيني للبرولاكتين (PRL) وعامل النمو الذي يشبه الأنسولين 1 (IGFBP1) استجابةً لـ MPA و cAMP. تم قياس النتائج عبر RT-qPCR ، وتم تطبيع التعبير لـ GAPDH. تم حساب الدلالة باستخدام اختبار t للطلاب (P & # 60 0.001 *** و P & # 60 0.0001 ****). تم عزل كلا خطي الخلايا باستخدام طريقة القشط. انقر هنا لمشاهدة صورة أكبر.

      التمهيدي تسلسل درجة حرارة التلدين (& # 176 درجة مئوية) دورات فحص
      البرولاكتين (PRL) إلى الأمام كاتاتجكجاتككتججاتجاجك 60 40 Sybrgreen
      البرولاكتين (PRL) عكسي تككتكاتكتكتاكاجكتتججا 60 40 Sybrgreen
      بروتين رابط عامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 (IGFBP1) إلى الأمام تككتتججاكجككاتكاجتاك 60 40 Sybrgreen
      بروتين ملزم لعامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 (IGFBP1) عكسي جاتكتككتجتجككتتجكتا 60 40 Sybrgreen
      جابده غير محدد (انظر قائمة الكاشف) 60 40 تقويمان

      الجدول 1. شروط PCR لعلامات decidualization.

      الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

      مناقشة

      قامت مجموعات أخرى بوصف وتكييف منهجية لتحضير ثقافات انسجة بطانة الرحم ، ومعظمها يستخدم كولاجيناز # 160 4،12،13،15-18. في هذه المخطوطة ، قدمنا ​​منهجية وأدلة لطريقتين مبسّطة لثقافة انسجة بطانة الرحم الأولية ، وكلاهما يستخدم من قبل مختبرنا لأسباب اقتصادية والتوافر الملائم للتربسين و / أو شفرة حلاقة.

      عند مقارنة طريقتنا ، كلاهما ينتج بنجاح ثقافات أولية قابلة للحياة. طريقتنا المفضلة هي طريقة التربسين حيث يكون هناك عائد أعلى مع متطلبات حجم عينة أصغر. ومع ذلك ، إذا كان وقت التحضير محدودًا ، فإن طريقة الكشط تتطلب 30 دقيقة بينما يستغرق طلاء الخلايا باستخدام طريقة التربسين أكثر من ساعة ونصف.

      ومن الجدير بالذكر أيضًا أننا نعرض هذه الأساليب باستخدام عينات استئصال الرحم بدلاً من خزعات بطانة الرحم. تؤخذ خزعات بطانة الرحم دون تدخل كبير وتميل إلى إنتاج عينات أصغر. ومع ذلك ، يجب أن تؤدي الطرق الموضحة في هذه المخطوطة (خاصة طريقة التربسين) إلى ثقافات من خزعات بطانة الرحم.

      هناك العديد من التطبيقات لخلايا انسجة بطانة الرحم الأولية. قد توفر مقارنة ثقافات انسجة بطانة الرحم من الثدييات البشرية مقابل الثدييات الأخرى أدلة على الأسئلة التي نوقشت لقرون حول سبب الحيض عند البشر. هناك دراسات فسيولوجية أخرى غير مكتشفة تتطلب ذلك في المختبر حضاره. تحظى الاكتشافات التي توفر نظرة ثاقبة لأحداث الدورة الإنجابية مثل النتائج التي ربطت الأحداث الجزيئية اللاجينية بالأحداث الوظيفية للدورة التناسلية # 160 19،20،21 ، ومراجعتها في المرجع & # 160 11 ، بأهمية خاصة.

      سيستفيد الأطباء بشكل كبير من دراسة زراعة انسجة بطانة الرحم وتحديد المؤشرات الحيوية في حالات الاضطرابات التناسلية والأورام الخبيثة السرطانية. بين عامي 2006 و 2010 ، أفيد أن 7.4 مليون امرأة وشركائهن استخدمن خدمات العقم في الولايات المتحدة & # 160 22. وترجع نسبة كبيرة من العقم إلى فشل عملية إزالة الجذور # 160 23. علاوة على ذلك ، لم يتم تقييم العلاقة بين أمراض بطانة الرحم مثل فرط تنسج بطانة الرحم والعقم إلا مؤخرًا. القدرة على دراسة سرطانات الرحم النسائية من خلال في المختبر النمذجة أيضًا لا تقدر بثمن لأنه على الرغم من ندرة الإصابة بساركوما بطانة الرحم المتقدمة ، إلا أنها قد تكون قاتلة. من خلال إنشاء في المختبر الثقافات الأولية ، ندرس تأثير الأحداث الجزيئية المرتبطة بالأمراض ويمكن أن تولد تطبيقات سريرية مفترضة.

      في الختام ، توليد ممثل وفعال في الجسم الحي نماذج للعديد من هذه التطبيقات صعبة. هذا يجعل تطوير في المختبر ثقافات بطانة الرحم الأولية لدراسة عدة في الجسم الحي وظائف حرجة. ستساعد هاتان الطريقتان لعزل بطانة الرحم ، & # 8220 ، طريقة الكشط & # 8221 و & # 8220 طريقة التربسين ، & # 8221 على توفير موطئ قدم لفهمنا لفيزيولوجيا بطانة الرحم وعلم الأمراض. & # 160 & # 160

      الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

      الإفصاحات

      الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

      شكر وتقدير

      نشكر الجهود التعاونية للدكتورة ثاو دانج وأعضاء مختبرها لاستخدام معدات التصوير والميكروسكوب الخاصة بهم. نشكر أيضًا مركز المستودع الحيوي ومرفق أبحاث الأنسجة (BTRF) ، جيف هاربر ، والمقيمين في جامعة فيرجينيا لتزويدنا بأنسجة الرحم. نشكر Karol Szlachta للمساعدة في نظرة عامة تخطيطية.


      تنظيم برنامج التشغيل التلقائي السريع واللوجستيات

      تعد برامج التشريح السريع معقدة من الناحية اللوجستية وتتطلب عمالة كثيفة ، وبالتالي فإن مفتاح النجاح هو مرونة البرنامج والحفاظ على تركيز متعدد التخصصات. المرونة مهمة لإنشاء الفريق المناسب لبيئة برنامج محددة ومجموعة من أهداف البحث. العديد من البرامج تحت الطلب على مدار الساعة وطوال أيام الأسبوع في كثير من الأحيان مع ما لا يقل عن فريقين متناوبين يغطيان نوبات أسبوع واحد أو نوبات متعددة. ومع ذلك ، يمكن أيضًا تشغيل البرامج الناجحة بواسطة فريق واحد فقط تحت الطلب لعدد محدود من الساعات كل يوم. عادة ما يقود هذه البرامج إما أخصائيي علم الأمراض أو أخصائيي الأورام ، على الرغم من أن العمل المتكامل بين التخصصين الفرعيين وبالتحديد بين الأطباء والباحثين أمر حاسم دائمًا لكي تزدهر البرامج على المدى الطويل. 16

      الخطوات النشطة لتنفيذ خطة عمل إعادة التوطين

      يمكن تقسيم التعاون الناجح في العلاقات المعقدة بين الأطباء والباحثين إلى سلسلة من خطوات العمل الواردة في الشكل & # x200B الشكل 1. 1. يعد مفهوم استخدام أنسجة ما بعد الوفاة والكميات المحتملة من الأنسجة أمرًا جديدًا بما فيه الكفاية بالنسبة لبعض الباحثين لدرجة أن هناك حاجة إلى بعض التفكير المسبق بعناية حول كيفية توافق خطة عمل إعادة التوطين مع المشاريع الحالية أو إنشاء طرق جديدة للتحقيق (CONSIDER). يجب تحديد عدد المرضى وأنواع العينة. يمكن أن تؤثر فترات ما بعد الوفاة (PMIs) بشكل ملحوظ على كيفية استخدام الأنسجة بنجاح ، ويجب تحديد المعلمات لسيناريوهات الحالات المختلفة (DEFINE ، MEET). يجب بعد ذلك مراجعة خطة عمل إعادة التوطين مع المشاركين المحتملين والأسر (المناقشات) ، والحصول على الوثائق القانونية المناسبة (الموافقة). يجب أن يعمل علماء الأمراض والباحثون و / أو العلماء الآخرون الذين يقومون بالتشريح السريع للجثة عن كثب قبل وأثناء وقت الجمع (COOPERATE) وأثناء التقييم والبحث اللاحق (COLLABORATE). أخيرًا ، يجب على أخصائيي علم أمراض التشريح السريع إنشاء حلقة اتصال حول نتائج البحث والتجارب العائلية واحتياجات الحالة المتطورة (FEEDBACK).

      التخطيط وخطوات العمل من قبل مدير RAP والباحث من أجل تعاون تشريح سريع ناجح للجثة.

      موافقة الدراسة

      جزء حاسم من أنشطة precase (قبل الموت) هو عملية الموافقة على الدراسة ، حيث يقوم المريض أو أقاربه القانونيون بإشارات ويعطي موافقته / موافقتها على جمع واستخدام أنسجته / استخدامها للبحث في المستقبل. قد تتضمن عملية الموافقة على الدراسة إذنًا صريحًا لمجموعة واسعة من الاستخدامات المستقبلية المحتملة (مثل التسلسل الجيني ، وتوليد خطوط الخلايا ، وتخزين الأنسجة ، ومشاركة الأنسجة مع الباحثين في مؤسسات مختلفة ، والتقاط صور للحالات ، واستعادة الشرائح والكتل من الخزعات السابقة وعينات الاستئصال ، وجمع عينات الدم قبل الأوان). بالطبع ، يمكن للمريض أن يقرر تقييد موافقته / موافقتها على النحو الذي قد يفضله.

      من المهم للغاية أن يتم الحصول على هذه الموافقة الفردية لعينات ما بعد الوفاة وأن تكون مكتوبة بعبارات عامة بما يكفي لاستخدامها مع المرضى الذين يعانون من جميع أنواع الأمراض. يبدو من المحتمل أن هذه الموافقة الفردية ستكون مطلوبة قريبًا للاختبارات الجينية وخطوط الخلايا ، حتى في المرضى المتوفين ، حيث أصبحت الهيئات التنظيمية على دراية بالإمكانات المتزايدة للأنسجة بعد الوفاة. بالإضافة إلى موافقة الدراسة اللازمة ، تتطلب عمليات التشريح السريع الموافقة على إجراء التشريح نفسه ، بنفس طريقة تشريح الجثة التشخيصي المنتظم.

      أهداف ونهج أخذ العينات

      يمثل كل تشريح سريع للجثة فرصة قوية لتزويد العديد من الباحثين بالعديد من العينات القيمة في نفس الوقت. على سبيل المثال ، يمكن أن توفر حالة تشريح جثة واحدة سريعة أنسجة الورم للباحثين الداخليين ، ونسيج لثلاث مؤسسات أخرى خارج الدولة (بما في ذلك المعاهد الوطنية للصحة) ، وأنسجة مخزنة للبرنامج نفسه ، بالإضافة إلى الضوابط العادية على الدماغ والعين والغدة النخامية والقلب وقناة البنكرياس والعضلات الهيكلية لمجموعات بحثية أخرى. لتحقيق ذلك ، من الضروري أن يكون لديك بروتوكولات أخذ العينات مرتبة مسبقًا التي تحدد أنواع الأنسجة والمعالجة اللازمة لهذا النوع من الإجراءات متعددة الأوجه أثناء الحالة. كل مجموعة بحث لديها ممثل معين ، ويتم الاتصال بهؤلاء الأشخاص كمجموعة بمجرد معرفة وفاة المريض.توفر فرق البحث موظفين تكميليين للمساعدة في تشريح الجثة ، مع اختلاف نطاق وتركيب هذه الفرق حسب عدد العينات المطلوبة ومدى المعالجة الفورية المطلوبة في الموقع. قد يكون من المفيد جدًا أيضًا أخذ عينات من كل آفة / نسيج طبيعي بالتوازي عن طريق تخصيص جزء من نفس المنطقة ليتم جمعها طازجًا في وسائط مثل RPMI ، وميض جزئي مجمّد في نيتروجين سائل أو مجمّد تدريجيًا في OCT ، وجزء فورمالين ثابت. يمكن أن تخلق الدراسات المقابلة التي تستخدم خطوط الخلايا أو مواد xenografts والتسلسل والتلطيخ الكيميائي المناعي تآزرًا ، مما يساعد على تحديد & # x0201clife دورة & # x0201d لخلية سرطانية. من المهم أن يكون لديك ما لا يقل عن عضو واحد في الفريق مخصص حصريًا لوصف العينات وتتبعها لتسهيل عملية أخذ العينات الموازية المهمة.

      توقيت وتجهيز العينات

      منذ بداية تطوير التشريح السريع للجثة ، كان المبدأ التنظيمي السائد لجميع برامج إعادة التوطين أنه يجب إزالة العينات أو الأعضاء ومعالجتها بأسرع ما يمكن. مع هذا الضغط من أجل & # x0201chigh-quality & # x0201d الأنسجة تأتي الحاجة إلى تحديد العلامات الحاسمة للجودة للأنسجة البشرية بعد الوفاة. 17،18 يُعرَّف مؤشر مديري المشتريات بأنه الوقت المنقضي بين وقت الوفاة والوقت الذي تم فيه وضع الأنسجة في المادة الحافظة (إما وسيط للعينات الطازجة ، أو التجميد المفاجئ في النيتروجين السائل ، أو التثبيت في الفورمالين). اعتمادًا على المركز والجوانب الخاصة للحالة المعنية ، يمكن أن يتراوح مؤشر PMI النموذجي بين 0.5 و 23 ساعة. يمكن أن تتأثر جودة الأنسجة بعد الوفاة من قبل PMI ، والحالات السابقة للوفاة (ناهض) ، وعوامل ما بعد الوفاة (ما قبل التحليل). تقليديا ، كان مؤشر PMI المنخفض هو السمة المميزة لجودة الأنسجة العالية. 19 ، 20

      على الرغم من أن تأثير مؤشر مديري المشتريات على أخذ العينات يمكن أن يكون فرديًا بدرجة كبيرة حسب نوع السرطان أو المرض وموئل جسم المريض ، يمكن استخلاص بعض المبادئ التوجيهية العامة لمؤشر PMI لأخذ العينات بنجاح من الأدبيات حول هذا الموضوع. كما هو مبين في الشكل & # x200B الشكل 2 ، 2 ، من الأفضل جمع عينات جديدة بها خلايا حية خلال 6 إلى 8 ساعات من الوفاة. يمكن تجميد عينات تسلسل الحمض النووي الريبي والحمض النووي أو وضعها في وسط به كاشف استقرار ويتم جمعها بشكل أفضل في غضون 12 ساعة من الوفاة على الأكثر. سيستمر علم الأنسجة والكيمياء المناعية في تحقيق نتائج جيدة بعد 12 ساعة من PMI. ومع ذلك ، فإن المؤلف لديه خبرة في نمو سلالات الخلايا من عينة مأخوذة بعد 12 ساعة عندما كان الإعداد (داخل منطقة نزيف) مناسبًا. يجب أن يناقش علماء علم الأمراض والباحثون في مجال التشريح السريع معًا ما هي المجموعات التي سيتم إجراؤها إذا كانت الظروف (مخاوف الأسرة ، أو الطقس ، أو المرور ، أو أي من الظروف الأخرى العديدة) قد تؤدي إلى تمديد مؤشر مديري المشتريات لفترة أطول مما كان مخططًا له.

      المبادئ التوجيهية المقترحة PMI لاستخدام عينة الأنسجة RAP الفعال.

      أمثلة على منظمات RAP الناجحة

      سيتم تسليط الضوء على المناهج المتنوعة لإنشاء وتنفيذ اللوجيستيات المعقدة لفريق RAP في الأمثلة الأربعة التي تمت مناقشتها أدناه.

      في المركز الطبي بجامعة نبراسكا ، يتوفر فريق بحث متناوب على مدار 24 ساعة ، 7 أيام في الأسبوع ، يتألف من فنيين بدوام كامل ، بمشاركة 3 فنيين عند الطلب ومساعدين في علم الأمراض. 21 يتكون برنامج المساعدة في إعادة التوطين التابع لجامعة ميشيغان في آن أربور من فريقين ، وفريق تشريح الجثة وفريق شراء الأنسجة ، يتم تنبيههم ويعملون معًا أثناء كل حالة ، وكلهم متاحون على مدار الساعة طوال أيام الأسبوع. يتكون فريق التشريح من أخصائي أمراض الجهاز البولي التناسلي ، وزميل أمراض الجهاز البولي التناسلي ، ومقيم في علم الأمراض ، ومساعد علم الأمراض. يتألف فريق شراء الأنسجة من أخصائي الأورام الطبي والعاملين وباحثين ما بعد الدكتوراه ومساعدي المختبرات ومقيم طب المسالك البولية. 4 في Weill Cornell ، يتألف فريق RAP من أخصائي تشريح الجثة ، ومقيم في علم الأمراض ، ومساعد تقني لتشريح الجثة ، و 2 إلى 4 أعضاء إضافيين بما في ذلك علماء الأمراض ، والباحثين ما بعد الدكتوراه ، وفنيي البحث الذين يساعدون في شراء الأنسجة والمعالجة الأولية. وقد يضم الفريق أيضًا أطباء وجراحين في علاج الأورام. 22 يتكون فريق Johns Hopkins RAP في بالتيمور ، ميريلاند ، من أخصائي علم الأمراض / مدير RAP ، ومنسق العينات ، ومساعد / مساعد تشريح الجثة للمساعدة في التشريح ، وزميل أو مدرب أبحاث علم الأمراض ، وفريق أبحاث مختلف في مجال السرطان والتخصصات الفرعية. أفراد. الفريق الأساسي متاح 7 أيام في الأسبوع لمدة 15 ساعة في اليوم.


      موضوعي

      لتطوير إجراء تشغيل قياسي (SOP) لجمع ونقل وتخزين أنسجة بطانة الرحم البشرية وعينات الدم ، والشروح التوضيحية للموضوع والعينة ، وتحديد أولويات العينة.

      تصميم

      يجمع SOP الإجراءات العلمية السليمة ، والأدبيات الخاصة بأبحاث نقص التروية ، وجمع العينات ، وتنميط التعبير الجيني ، والممارسات المختبرية الجيدة ، وخبرة المؤلفين في سير العمل وجودة العينة.

      ضبط

      المعاهد الوطنية للصحة ، جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو ، أنسجة بطانة الرحم البشرية وبنك الحمض النووي.

      مرضى)

      النساء اللواتي يخضعن لخزعة بطانة الرحم أو استئصال الرحم لمؤشرات غير خبيثة.

      التدخل (ق)

      جمع ومعالجة وتخزين وتوزيع أنسجة بطانة الرحم وعينات الدم بموجب بروتوكولات مجلس المراجعة المؤسسية المعتمدة والموافقة الخطية المستنيرة من الموضوعات المشاركة.

      مقاييس النتائج الرئيسيه)

      إجراءات التشغيل القياسية.

      نتائج)

      يتناول الإجراء التشغيلي الموحد شرحًا صارمًا ومتسقًا للموضوع ، ومعالجة العينات وتوصيفها ، والامتثال التنظيمي الصارم ، ومرجع للباحثين لتتبع أوقات التجميع والتخزين التي قد تؤثر على أبحاثهم.

      الاستنتاج (الاستنتاجات)

      يضمن النهج الشامل والمنهجي لشراء الدم البشري وأنسجة بطانة الرحم في هذا الإجراء التشغيلي الموحد الجودة العالية والموثوقية والفائدة العلمية للعينات الحيوية المتاحة للباحثين من قبل المعاهد الوطنية للصحة ، جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو ، أنسجة بطانة الرحم البشرية وبنك DNA. توفر التفاصيل والمنظور في هذا الإجراء التشغيلي القياسي أيضًا مخططًا لتنفيذ برامج التجميع المماثلة في المؤسسات الأخرى.


      2 النتائج والمناقشة

      2.1 بروتوكول التحضير: نظرة عامة واعتبارات عامة

      يتم تلخيص الإجراء بأكمله المفصل في القسم 3 هنا وهو مدرج في الجدول 1. الحركية بالتبريد لمزارع الخلايا الحيوانية عن طريق التجميد المفاجئ تحت ضغط مرتفع (التجميد عالي الضغط [HPF] 36 ، 37) يتبعه FS ، إزالة الثقيلة المثبتات المعدنية وعينة من الرطوبة النسبية في درجات حرارة تحت الصفر. يتم إجراء الشطف والتثبيت اللاحق على الثلج. أخيرًا ، تخضع العينات للنفاذية باستخدام المنظفات في درجة حرارة الغرفة ووضع العلامات غير المباشرة قبل التضمين المناعي باستخدام اتحادات NANOGOLD-Fab′.

      الكواشف زمن درجة حرارة
      FS إلخ. استبدال التجميد أسيتون + 0.2٪ UA + 0.5٪ GA + 0.05٪ OsO4 + 1٪ ميثانول + 5٪ ماء ≈18 ح 68 −90 درجة مئوية
      إحماء حتى -35 درجة مئوية الأسيتون + UA / GA / OsO4 ≈34 ساعة 68 −90 درجة مئوية إلى -35 درجة مئوية
      الحضانة عند -35 درجة مئوية الأسيتون + UA / GA / OsO4 ≈19 ساعة −35 درجة مئوية
      غسل المعادن الثقيلة أسيتون + 0.5٪ GA 4 × 30 دقيقة
      شطف أسيتون + 0.5٪ GA 45 دقيقة
      ر معالجة الجفاف رقم 1 (جزئي) 50٪ أسيتون + 50٪ ماء + 0.5٪ GA 10 دقائق على الجليد
      RH # 2 (جزئي) 25٪ أسيتون + 75٪ ماء + 0.25٪ GA 10 دقائق
      RH # 3 (مكتمل) + 0.25٪ ماء 5 دقائق
      بوستفيكسيشن + 0.25٪ ماء 120 دقيقة
      شطف ماء 3 × 10 دقيقة + 4 درجة مئوية
      PHEM 3 × 10 دقيقة RT
      تخزين PHEM تشغيل + 4 درجة مئوية
      مختبر نفاذية → 3 شطف PHEM + 0.05٪ TritonX-100 → PHEM 30 دقيقة ← 3 × 10 دقائق RT
      تعطيل الألدهيدات PHEM +0.05 م جليكاين 15 دقيقة
      المنع PHEM + 5٪ BSA + 0.1٪ CWFG 30 دقيقة
      شطف PHEM + 0.1٪ BSA-c 3 × 3 دقيقة
      حضانة الجسم المضاد (AB) AB الأساسي في PHEM + 0.1٪ BSA-c 180 دقيقة
      شطف PHEM + 0.1٪ BSA-c 6 × 10 دقيقة
      حضانة AB AB-Fab’-NANOGOLD الثانوية في PHEM + 0.1٪ BSA-c 60 دقيقة → O / N → 60 دقيقة RT → + 4 ° C → RT
      شطف PHEM + 0.1٪ BSA-c 3 × 10 دقيقة RT
      PHEM 6 × 2 دقيقة
      بعد التثبيت PHEM + 2٪ GA 10 دقائق
      شطف PHEM 6 × 5 دقائق
      أ. مصير. 6 × 2 دقيقة
      تعزيز الفضة HQ- فضي 8 دقائق
      التبريد 1٪ حمض الخليك في AQ. مصير. 2 × 1 دقيقة
      شطف ع. مصير. 6 × 10 دقيقة
      EMB إلخ. تلطيخ Postfixation / en-bloc 0.5٪ OsO4 في Aq. مصير. 15 دقيقة
      شطف أ. مصير. 3 × 10 دقيقة
      تلطيخ Postfixation / en-bloc 0.2٪ UA في Aq. مصير. تشغيل + 4 درجة مئوية
      شطف أ. مصير. 3 × 10 دقيقة RT
      تجفيف المذيبات ، تسلل الراتينج ، البلمرة ، الفحص الدقيق ، (تلطيخ القسم الاختياري) ، EM

      اقترانات NANOGOLD عبارة عن علامات صغيرة جدًا 3 ذات نواة ذهبية تبلغ 1.4 نانومتر فقط ، وعادة لا يمكن التعرف عليها في البيئة الحبيبية والصاخبة للخلايا التي تتم معالجتها من أجل EM (باستثناء بعض أساليب التصوير EM المتطورة ، انظر ، على سبيل المثال ، المرجع. 38). وبالتالي ، يجب زيادة حجم هذه الجسيمات عن طريق ترسيب الفضة المعدنية على سطح الذهب. يُعرف هذا الإجراء 39 باسم تحسين الفضة (SE ، أو التصوير الآلي) ، وهو يعتمد على تفاعلات كيميائية مشابهة لتطوير الأفلام بالأبيض والأسود وله تحدياته وقيوده الخاصة ، كما هو موضح أدناه في القسم 2.6. بعد التضخيم الآلي للجزيئات المناعية ، تخضع العينات لتلطيخ الكتلة ، وتضمين راتينج قياسي ، وتقطيع وتحليل رقيق جدًا أو شبه سميك بواسطة EM ، تكمله إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للتصوير المقطعي.

      2.2 ثقافة الخلية ، التجميد ، FS

      خطوط الخلايا الظهارية البشرية (CaCo2، HeLa) والأرومات الليفية الجنينية للفأر (MEF) على أغشية المرشح البلاستيكية (CaCo2) أو على أقراص الياقوت المطلية بالكربون. تشكلت 40 ، 41 HeLa و MEF طبقات أحادية مسطحة تمامًا غير متكدسة ، نما CaCo2 كطبقة متكدسة ، يصل ارتفاعها إلى ≈20 ميكرومتر ، طبقات أحادية مستقطبة. تم إجراء HPF كما هو موضح سابقًا بالتفصيل. 40 ، 41

      بالنسبة إلى FS ، قمنا باختبار وسائط مختلفة مصنوعة من الأسيتون بالإضافة إلى المثبتات وبقع الكتلة. بالنسبة للعينة اللاحقة RH (الجدول 1) ، قمنا بتعديل البروتوكولات من مجموعات في Utrecht و Tübingen. 22 ، 23 تحتوي جميع وسائط FS لدينا على أسيتات اليورانيل (UA) ، وفقًا للدراسات السابقة التي أجراها آخرون على FS-RH 22 ، 23 والتي أكدت تأثير التثبيت المعروف لـ UA على دهون الغشاء. 18، 42-45 مزيج FS من الأسيتون زائد UA (0.2٪ وزن / حجم) ، جلوتارالدهيد (GA 0.5٪ حجم / حجم) ، رابع أكسيد الأوزميوم (OsO4 0.05٪ وزن / حجم) ، ماء (توزيع أقصي 5٪ حجم / حجم) والميثانول (1٪ حجم / حجم) أعطت أفضل النتائج باستمرار. وفقًا للحكم من الأقسام الرقيقة القياسية 100 نانومتر ، ظهر التركيب الخلوي الدقيق لعينات FS-RH بشكل عام محفوظ جيدًا (على سبيل المثال ، الشكلان 1 و 2 AB) ، مشابه تمامًا لعينات FS الكلاسيكية (على سبيل المثال ، المرجع 40: الشكل 1 المرجع 41: الأشكال 1B و 4G). القسم اللاحق مع UA والرصاص زاد من تباين العينة ، لكنه لم يكن إلزاميًا لتصور التفاصيل الخلوية بشكل كافٍ.

      2.3 ما قبل التضمين المناعي- EM

      أسفر كوكتيل UA / GA / OsO4 للخدمة الثابتة عن وضع العلامات المناعية المناسبة (على سبيل المثال ، الشكلان 1 و 2 أ الشكل S1A-C) مع اختيار لائق من الأجسام المضادة التي تم اختبارها حتى الآن (مدرجة في القسم 3.3). تم تطبيق ذخيرة الأجسام المضادة هنا على الخلايا البشرية والفأرية للتعرف على البروتينات الداخلية والموسومة ، مثل الاتحادات مع HA و GFP (هيماجلوتينين الإنفلونزا ، والبروتين الفلوري الأخضر ومشتقاته). تضمنت المقارنة مع التقنيات المعمول بها العديد من الضوابط المنهجية والبيولوجية للتحقق من صحة خصوصية الملصقات (انظر القسم 3.6 والشكل S6) ، بالإضافة إلى التقديرات الكمية المختارة. يوضح الشكل S1 اكتشاف بروتين الغشاء الداخلي / الليزوزومي المتأخر LAMP1 (بروتين الغشاء المرتبط باللايسوزوم -1) بواسطة جسم مضاد أحادي النسيلة 46 في خط MEF موصوف مسبقًا. 40 ، 47 تم الحصول على أنماط وضع العلامات المتطابقة تمامًا مع متغيرين من نهج التضمين المسبق القائم على التبريد ومع التضمين المسبق التقليدي أو Tokuyasu cryosection IEM.

      لاختبار مرونة نهجنا ، استخدمنا أيضًا مجموعات أخرى من الكواشف (الشكلان S3 و 4) ، كبديل عن UA / GA / OsO4 المفضل لدينا. بروتوكول واحد لـ FS و RH ، على سبيل المثال ، تضمن FA بدلاً من GA ، إلى جانب UA و OsO4. هنا ، كانت كثافة الحفظ الهيكلية والتسمية مرضية (الشكل S3A ، B) وأحيانًا جيدة جدًا ، على الرغم من أن تباين العينة كان أقل من كوكتيل UA / GA / OsO4. مثل هذه العينات الخالية من GA من الخلايا المزروعة على أقراص (شبكية) من الياقوت تتجنب مشكلة التألق الذاتي الناجم عن GA ، وبالتالي يمكن أن تكون مفيدة لأنواع معينة من الفحص المجهري الفلوري التكميلي وتحليلات EM. 11 ، 48 ، 49 والجدير بالذكر أن غالبية الأجسام المضادة التي تم اختبارها حتى الآن باستخدام نهج التضمين المسبق القائم على التبريد كانت متوافقة مع كوكتيلات FS التي تحتوي على ما يصل إلى 0.05٪ من OsO4 (في المجموع: 11 من أصل 16). قد يبدو هذا مفاجئًا للوهلة الأولى. ومع ذلك ، تتوافق بياناتنا مع عدد قليل من التقارير 18 ، 34 ، 50 التي تفيد بأن حلول OsO4 المخففة للغاية لا تلغي بالضرورة نشاط مولد الضد أو نشاط الإنزيم ، خاصةً عند إجراء التناضح في درجات حرارة منخفضة.

      أخيرًا ، قمنا بخلط كوكتيل FS يحتوي على UA و GA فقط كمثبتات / بقع مصممة للأجسام المضادة التي فشلت تمامًا مع العينات المعالجة بالأوزميوم. توطين LC3 الداخلي ، وهو علامة ذاتية النية ، بمثابة مثال لهذه السلسلة من التجارب. لقد أجرينا IEM القائم على التبريد والتقليدي قبل التضمين ، بالإضافة إلى وضع العلامات بالتجميد Tokuyasu باستخدام جسم مضاد تجاري في HeLa (الأشكال S3C ، S4E-K). تمشيا مع تقارير IEM السابقة ، 51 ، 52 ملصق LC3 الموجود على الغشاء الداخلي والخارجي للعضيات متعددة الأشكال ، يتم تفسيره شكليًا على أنه جسيمات تلقائية (الشكل S4E) ، بالإضافة إلى توزيعه السيتوبلازمي (الشكل S3C). قيمت تجارب التحكم أصل البلعمة الذاتية لهذه المقصورات علاوة على ذلك ، ما إذا كان الارتباط التفضيلي المرصود بالفضة والذهب المناعي للملامح الأساسية للعضيات يعكس حقًا LC3 الداخلي. لهذا ، قمنا بتحليل WT و GFP-LC3 HeLa المحرومين من الأحماض الأمينية والمصل لمدة ساعتين وعولجنا باستخدام bafilomycin A1 (BafA). أدى التجويع مع الحجب المتزامن للتدفق الذاتي 53 إلى زيادة عدد الهياكل الإيجابية لـ LC3 ، كما يتضح من الفحص المجهري الفلوري (الشكل S4A-D) وتقدير EM (الحالة المستقرة 10.6 ± 1.5 مقابل الجوع / المحظورة 23 ± 2 عضيات لكل 100 ميكرون مربع يعني ± SEM). أظهرت تحليلات IEM التكميلية والكمية تسمية كل من LC3 و GFP-LC3 المناعي للتركيز على اللب الداخلي للبلعوم الذاتية المفترضة (الشكل S4E-M). إجمالاً ، دعمت هذه النتائج تفسيرنا للبنية التحتية واقترحت بشدة توزيع ملصق LC3 المناعي الداخلي ليكون محددًا.

      2.4 التصوير ثلاثي الأبعاد

      لتوطين ونمذجة الملصق المناعي في سياق الهندسة ثلاثية الأبعاد للعضيات ، استخدمنا محورًا فرديًا ومزدوجًا ET مع أقسام راتنجات إيبوكسي من 300 إلى 400 نانومتر من عينات UA / GA / OsO4- أو UA / GA. أثبت التصوير المقطعي للإرسال EM (TEM) والمسح الضوئي لـ TEM (STEM) الذي تم إجراؤه باستخدام خيوط Lab6 عند 200 كيلو فولت أنه ممكن (الشكلان 2B-D و 3 أفلام S1 و S2). والجدير بالذكر أن وجود أو عدم وجود OsO4 في وسائط FS كان له تأثير طفيف فقط على رؤية التفاصيل الخلوية في معيار 2D TEM (على سبيل المثال ، الشكل S3C). في حالة التصوير المقطعي من المقاطع شبه السميكة ، أدى غياب OsO4 في وسائط UA / GA إلى انخفاض تباين العينة ، وبالتالي إعادة البناء الأقل إشراقًا. القسم اللاحق بحمض الفوسفوتونجستيك الإيثانولي الساخن ، 54 كما تم تقديمه سابقًا لـ ET من الخميرة المبردة ، 55 لم يحسن بشكل واضح تباين خلايا الثدييات هذه. معًا ، نعتبر العينات التي تمت معالجتها وفقًا لـ UA / GA / OsO4 ولكن أيضًا بروتوكول UA / GA الموضح هنا على أنه مناسب لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد (الأفلام S1 و S2) ، بما في ذلك الأساليب الأخرى غير التصوير المقطعي. يمكن أن يسمح طحن الحزمة الأيونية المركزة (FIB 56: وبياناتنا غير المنشورة) أو واجهة الكتلة التسلسلية SEM 57) أو EM 58 عالي الجهد بإعادة بناء عينات بسمك عدة ميكرون مثل الخلايا بأكملها - وهو هدف ليس كذلك ( بسهولة) يتم تحقيقه عن طريق الجهد المتوسط ​​ET من أقسام شبه سميكة ≈400 نانومتر.

      2.5 سهولة الوصول إلى الكواشف

      كفاءة الاختراق للأجسام المضادة ، اقترانات NANOGOLD و / أو كواشف SE اختلفت بين خلايا عينة معينة ، بغض النظر عن شروط FS و / RH و / أو نفاذية. أظهرت الخلايا المستنبتة على أغطية من الياقوت الارتباط المتوقع بين أنماط الحفظ والتوسيم: تحتوي الخلايا المجمدة جيدًا على ما يبدو على جزيئات فضية من الذهب أصغر وأقل من الخلايا ذات الأضرار المعتدلة ، على الرغم من أنها لا تزال مقبولة. لأسباب غير معروفة ، كان هذا الارتباط الواضح واضحًا في بعض الأحيان فقط في الخلايا المزروعة على أغشية المرشح. على أي حال ، لم يلاحظ أي تدرجات داخل الخلايا من غشاء البلازما إلى الغلاف النووي - وبالتالي ، لم تتغير كثافات التسمية بشكل كبير عبر مجموعة عضية معينة داخل نفس الخلية.

      أسفرت تجربة وضع العلامات التي تعتبر إيجابية عن 30 ٪ من العينات الصالحة للاستخدام. يعتمد هذا التقدير التقريبي على الفحص البصري لمقاطع رقيقة 100 نانومتر بواسطة TEM القياسي. أظهرت كل دفعة من عينات UA / GA / OsO4 التي تمت معالجتها بالتوازي (≈8 ياقوت أو قطع مرشح) كميات متساوية تقريبًا من (1) خلايا محفوظة بشكل كافٍ ومُعنون ، (2) (تقريبًا) خلايا غير مصنفة و (3) ) خلايا ذات خلفية فضية مناعية غير مقبولة وقوية في جميع أنحاء العينة بأكملها (قارن الشكل S5 مع جميع الأشكال الأخرى والأرقام التكميلية). كان الحصاد الذي تم الحصول عليه مع البروتوكولات الأخرى متغيرًا.

      أشارت بياناتنا إلى أن وضع العلامات قبل التضمين القائم على التبريد يمكن أن يعمل بشكل أساسي دون أي نفاذية إضافية للعينة قبل حضانة الجسم المضاد (على سبيل المثال ، الشكل S1A-C ، G). من الواضح أن نمو بلورات الجليد (الدقيقة) داخل الخلايا أثناء التجميد ، FS و / أو RH هو السبب الرئيسي ، وهو يخدم أساسًا كافيًا للنجاح في التضمين المناعي المسبق لعينات FS-RH المثبتة بالتبريد. ومع ذلك ، تم تحقيق كثافات أعلى نسبيًا باستخدام الخلايا المعالجة بالمنظفات (على سبيل المثال ، الشكل S1G). دفعتنا هذه الملاحظة إلى تقييم الخيارات لتسهيل انتشار الكواشف إلى خلايا تبدو مجمدة جيدًا تظهر عليها السيتوبلازم المحفوظة جيدًا ، ومن المفترض أن تكون هذه السيتوبلازم غير قابلة للاختراق — ولكن دون التأثير على التكامل تحت الخلوي. لهذا الغرض ، قمنا بتعريض الخلايا لتركيزات مختلفة من Triton X-100 (TX-100) أو Saponin ، أو لتجميد الذوبان قبل حضانة الجسم المضاد. والجدير بالذكر أن أياً من هذه التلاعبات لم يتدخل بشكل واضح في الحفاظ على البنية التحتية لخلايا FS-RH ، ولا حتى الحضانة بنسبة 0.2 ٪ TX-100. هذا يتناقض بشدة مع النتائج من البروتوكولات القياسية. 9 من أجل نفاذية العينات التقليدية المثبتة بمحلول ألدهيد مائي ، يُفضل استخدام الصابونين على نطاق واسع كمنظف "معتدل" على مادة TX-100 "القاسية" والأكثر تدميراً. 9 يمكن للمرء أن يتكهن فقط بأسباب هذا الاختلاف بين IEM التقليدي والتضمين المسبق القائم على التبريد على أساس البيانات المتاحة حتى الآن.قد تفسر الأنماط المختلفة وعمل تثبيت العينة 59 ، 60 جزئيًا هذه الظاهرة: جودة ومدى استقرار البروتين ليسا نفس الشيء الذي تم تحقيقه بواسطة FS-RH بالإضافة إلى التثبيت اللاحق المائي ، أو عن طريق التثبيت المائي في درجات الحرارة المحيطة بأنواع مختلفة من الألدهيدات (تلك مرة أخرى ، تختلف في خصائصها المتشابكة 1 ، 33 ، 42). فضيلة استقرار الفوسفوليبيد في UA 1، 33، 42 هي عامل آخر ربما يساهم بطريقة مواتية ومكملة للمقاومة الملحوظة لعينات FS-RH الخاصة بنا للتآكل الناجم عن المنظفات (بياناتنا unpub.). تم تضمين هذا الكاشف باستمرار في جميع وسائط FS لدينا ، ولكنه ليس جزءًا من بروتوكولات التثبيت التقليدية والتضمين المسبق. مجتمعة ، نحن نعتبر نفاذية المنظفات الإضافية ليست شرطًا أساسيًا لا غنى عنه للتضمين المسبق لوضع العلامات المناعية للخلايا المبردة وخلايا FS ، ولكن كخيار مفيد. يتضمن تدفق العمل القياسي لدينا ، بالتالي ، تعرضًا لمدة 30 دقيقة لـ TX100 بتركيز معتدل قدره 0.05٪ ، على غرار البروتوكولات المعمول بها 7 لـ IEM التقليدي للتضمين المسبق.

      2.6 تصور NANOGOLD

      كما هو معروف من أي اتحاد ذهب صغير للغاية يخضع لـ SE ، 10 ، 43 ، 61 ، فإن جزيئات الفضة NANOGOLD المتولدة هنا تختلف في الحجم والشكل (على سبيل المثال ، الشكلان 1 ب و 2 أ) ، بما في ذلك مجاميع العديد من جزيئات NANOGOLD داخل نفس الفضة صدفة. 10 ، 43 ، 61 لمجرد تحليلات TEM النوعية في عدم تجانس الجسيمات ثنائية الأبعاد تبدو مشكلة جمالية أكثر منها مشكلة أساسية. ومع ذلك ، في الحجم الأكبر للتصوير المقطعي ، يصبح حجم وشكل الجسيمات غير المتكافئين أكثر وضوحًا (الشكلان 2 ج و 3 أ) وأحيانًا يكونان مزعجين. هذا ينطبق بشكل خاص على كمية التسمية الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، تقلل شذرات الفضة والذهب غير المنتظمة المصنوعة من تراكمات NANOGOLD المكثفة من الدقة (أي الدقة المكانية) لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد لتوزيع المستضد. 10 اقترانات الذهب الأخرى مع / بدون SE اللاحقة (كما هو مستخدم ، على سبيل المثال ، في المرجع 62) فشلت في أيدينا ، لأنها اخترقت فقط الخلايا التي تعاني من تلف غير مقبول في بلورات الثلج. وبالتالي ، فإن العثور على إجراءات التعزيز المعدلة وإنشاءها 63 ، 64 لإنتاج جسيمات علامة أكثر تناسقًا لها أولوية قصوى لتحسين مفهوم IEM القائم على التبريد القائم على التضمين المقدم هنا.

      2.7 الخلاصة

      وصفنا هنا بروتوكول إعداد EM لثقافات الخلايا الملتصقة ، والذي يسمح بربط تثبيت العينات الأصلية بالتبريد قبل التضمين المناعي ، كخطوة نحو رسم خرائط ثلاثية الأبعاد محسّنة لتوزيع المستضد دون الخلوي بدقة عالية. يمكن تلخيص فضائله الرئيسية على النحو التالي:

      (1) يمنع الإيقاف الفوري للتغير الديناميكي التشكل الخلوي من خلال وسائل فيزيائية بحتة (أي التجميد السريع) الآثار الهيكلية المصاحبة للتثبيت الكيميائي التقليدي البطيء نسبيًا. (2) التثبيت الكيميائي الشامل لمعمارية الخلية المجمدة السريعة عند درجات حرارة منخفضة جدًا (أي FS عند ≈ 90 إلى -30 درجة مئوية) يحافظ على موضع وأبعاد ونسب المكونات دون الخلوية ، بما في ذلك النطاقات الفرعية للعضيات ، وبالتالي توزيع المستضد بطريقة موثوقة للغاية. (3) أثبتت الخلايا المصنفة بشكل صحيح أنها مخترقة بشكل موحد بجزيئات الفضة من الذهب المناعي عبر حجمها بالكامل (الشكل S2C) ، مما يوفر أساسًا قويًا لعمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد. (4) باستثناء الخبرة العملية في HPF و FS ، لا توجد مهارات تقنية خاصة مطلوبة هنا ، نظرًا لأن إنتاج أقسام راتينج رفيعة وشبه سميكة لا يمثل تحديًا حتى بالنسبة للمبتدئين في EM ومجموعة بيانات عادلة من ملفات التعريف الخلوية الموازية أو الموازية الموجهة بدقة يمكن الحصول بسهولة على ركائز الثقافة ثنائية الأبعاد بشكل متعامد.


      أسئلة اختبار الأنسجة

      يقوم معمل الأنسجة بإعداد شرائح مجهرية لفحصها باستخدام مجهر ضوئي.

      لماذا علم الأنسجة مهم؟

      علم الأنسجة هو أفضل طريقة لفحص الأنسجة. علم الأنسجة عبارة عن مجموعة من آلاف التقنيات التي تم إتقانها على مر السنين. يعتمد الأطباء على أخصائي الأنسجة يوميًا للحصول على نتائج سريعة ودقيقة. يعتمد الطب الحديث على علم الأنسجة أكثر فأكثر كل عام. أكثر من 80٪ من جميع التشخيصات تتضمن نوعًا من الاختبارات المعملية.

      ما هي بقعة H & ampE؟

      توضح بقعة H & ampE نواة الخلية والسيتوبلازم وبعض التفاصيل الخاصة بالنواة والسيتوبلازم.

      ما هي معالجة البارافين؟

      تقوم معالجة البارافين بتحويل العينات إلى حالة كيميائية تمكنها من قطعها بشكل رفيع جدًا لتوضع على شريحة مجهرية.

      كم من الوقت يستغرق متوسط ​​العينة للانتقال من الربح إلى الشريحة النهائية؟

      سيتم جمع العينة النموذجية ومعالجتها وتقطيعها وتلطيخها في غضون يومين تقريبًا. قد تستغرق العينات غير النموذجية مثل العينات اللاصقة أو العينات العصبية الكبيرة جدًا أكثر من أسبوع.

      ما هي الإجراءات التي توصي بها للحصول على أفضل النتائج؟

      نوصي بأن يتم غمر العينة بكمية كبيرة من الفورمالين المخزن المحايد بنسبة 10٪ في أسرع وقت ممكن بعد مرور المريض أو الحيوان أو التضحية به. إذا كنت تجري دراسات على المخ أو أي نسيج عصبي آخر ، فيجب تقليل الوقت بين الموت والغرق في الفورمالين المخزن المحايد بنسبة 10٪. يوصى بـ 5-10 دقائق لعينات الدماغ والحبل الشوكي. يعد الوصول إلى الدماغ مهمة صعبة للفنيين عديمي الخبرة ، وغالبًا ما يتم وضع شظايا العظام في الدماغ أثناء العملية. ستؤدي هذه الشظايا إلى نتائج سيئة أثناء تقطيع الشرائح لأن العظام تتكون في الغالب من الكالسيوم. نوصيك بشطف المخ جيدًا باستخدام الفورمالين المحايد بنسبة 10٪ لإزالة أي غبار أو شظايا عظمية قبل أن تعمل في عمق الأنسجة. بالنسبة لدماغ الفأر ، قد ترغب في استخدام حوالي 50 مللي من 10٪ من الفورمالين المحايد المخزن مؤقتًا لكل دماغ. نظرًا لأن الأنسجة & # 8220 مثبتة & # 8221 بالفورمالديهايد في الفورمالين المحايد المخزن بنسبة 10 ٪ ، يتغير الرقم الهيدروجيني للمحلول. إذا تغير هذا الرقم الهيدروجيني كثيرًا ، فسيكون لديك تثبيت ضعيف وربما أصباغ وتشوهات في عينتك. القاعدة العامة هي استخدام 15 ضعف كمية السوائل مثل حجم عينتك. إذا كانت لديك عينة بحجم 3 سم في 3 سم ، فستحتاج إلى استخدام 45 مل من الفورمالين المحايد بنسبة 10٪. إذا كان لديك عينة بحجم 20 سم × 20 سم ، فستحتاج إلى استخدام 300 مل من الفورمالين المحايد بنسبة 10٪. إن استخدام أي محلول فورمالديهايد بخلاف الفورمالين المخزن المحايد بنسبة 10٪ سيؤدي دائمًا إلى نتائج سيئة. 10٪ الفورمالين المحايد المخزن هو المعيار المستخدم في المستشفيات والعيادات البيطرية. يساعد المخزن المؤقت في المحلول أنسجتك على الإصلاح بشكل صحيح دون الحاجة إلى مراقبة درجة الحموضة ، طالما أنك تتبع نسبة 1 & # 21515 من الأنسجة إلى السوائل. لن تعمل بعض إجراءات إزالة البقع مع الفورمالين المحايد المحايد بنسبة 10٪ ، ولكن تظل الحصة 1 & # 21515 سارية إذا كنت تستخدم أنواعًا أخرى من المثبتات. غالبًا ما يستخدم الكحول كمثبت للتلوين المتقلب على العينات المجمدة ، عادةً كحول الميثيل.

      إذا كنت تقدم أعضاء بها خصائص تشبه الكبسولة ، مثل الكلى أو الكبد والقلب والرئة ، وخاصة الجهاز الهضمي & # 8230 .. سترغب دائمًا في قطع هذه الكبسولة للسماح للفورمالين المحايد المحايد بنسبة 10٪ بالوصول إلى الداخل جزء من العضو. نوصي بعمل بضع جروح صغيرة بطرف مشرط ، واحدة على كل جانب من العضو. بالنسبة إلى الرئتين ، نوصي بشدة بنفخ الرئتين بالكامل باستخدام الفورمالين المحايد بنسبة 10٪ ، واستخدام محقنة لهذا الإجراء وسيكون الأمر سهلاً للغاية. إذا قمت بتقطيع الرئة إلى 5-10 عينات ، فسيكون لذلك نتائج رائعة أيضًا. يحتوي الجزء الداخلي من الرئة على العديد من التفاصيل الصغيرة التي ستختفي بعد بضع ساعات إذا لم يتم إصلاح الرئة بشكل صحيح. ستظهر عينات الجهاز الهضمي نتائج مذهلة إذا تم إصلاح الأجزاء الداخلية للأعضاء بشكل صحيح. يمكن أيضًا استخدام حقنة لهذا الإجراء. إذا كنت تقدم عينات من حيوان أو شخص ويبدو أن المعدة أو الجهاز الهضمي مليئة بالطعام ، وخاصة الأطعمة الخشنة مثل علف الفأر أو الحبوب أو النباتات أو أي شيء يحتوي على ألياف أو أي طعام بشكل عام & # 8230. تنظيف الجزء الداخلي من هذه الأعضاء سيعطي نتائج أفضل. ما لم تكن تدرس الطعام على هذه الأعضاء ، فلن تكون هناك حاجة للطعام وسيؤدي غالبًا إلى نتائج سيئة على العينات التي يتم التعامل معها بشكل صحيح.

      إذا كنت ستقدم عظمًا ، فإن الخطأ الشائع هو وضع العظم فورًا في محلول إزالة التكلس. يحتاج العظام إلى الإصلاح مثل أنواع الأنسجة الأخرى. إذا لم يتم إصلاحه ، فلن يتم تقطيعه على الإطلاق ، ينتهي بك الأمر بمسحوق بدلاً من مقطع عرضي. ترجع العديد من المشكلات في عينات العظام إلى عدم إصلاح العينة قبل بدء إزالة التكلس. تقوم عملية إزالة التكلس بسحب الكالسيوم عبر الأنسجة إلى سائل اللاصق. عندما يتحرك الكالسيوم عبر العظام فإنه يتسبب في أضرار جسيمة لمكونات العظام الأخرى إذا لم يتم إصلاحها. خطأ شائع آخر في إزالة التكلس من العظام هو استخدام غسلة واحدة من المحلول. النسبة 1 & # 21515 من الأنسجة إلى السوائل هي النسبة الصحيحة لإجراء إزالة التكلس ، ولكن يجب تغيير السائل عدة مرات لإزالة كل الكالسيوم. يمكن إجراء اختبار كيميائي بسيط على سائل إزالة الكالسيوم لتحديد نقطة النهاية الدقيقة للإجراء. بدلاً من ذلك ، إذا كنت جيدًا في الكيمياء ، يمكنك في الواقع معرفة مقدار الحمض الذي ستحتاجه لإذابة الكالسيوم بالكتلة في عينتك.

      نوصي باستخدام الإجراء التالي لإزالة التكلس.

      الحلول المطلوبة:

      استخدم أجزاء متساوية من محلول هيدروكسيد الأمونيوم بنسبة 5٪ ومحلول أكسالات الأمونيوم بنسبة 5٪ لعمل محلول العمل.

      أضف 5 مل من سائل اللاصق الموجود في عينتك إلى 10 مل من محلول العمل.

      راقب أي ترسبات تشكل. إذا رأيت راسبًا (سيكون من السهل رؤية الغيوم) ، قم بتغيير سائل إزالة التكلس وانتظر يومًا أو يومين ثم حاول الاختبار الكيميائي مرة أخرى.

      بعد القيام بالإجراء عدة مرات باستخدام عينات مختلفة ، ستبدأ في أن تكون قادرًا على إجراء تخمينات مستنيرة لأوقات الملصقات اللازمة بناءً على حجم العينة وكتلتها.

      هذه هي خطوات تحضير عينة الأنسجة بترتيب زمني.

      تفصيل التفاصيل لكل خطوة في علم الأنسجة من القائمة أعلاه:

      الخطوة الأولى هي الحصول على عينة الأنسجة. سيقوم أخصائي الأنسجة أو أخصائي علم الأمراض بإزالة العينة من حاوية الشحن / النقل الخاصة بها. قد تكون الحاوية عبارة عن صندوق أو كيس أو مبرد. إذا تم تجميد العينة ، فيجب وضعها في تجميد -20 أو -80 في أسرع وقت ممكن. يجب مراجعة أي معلومات مكتوبة مضمنة في العينة للتأكد من صحة العينة والمعلومات ومطابقتها.

      الخطوة الثانية هي الانضمام إلى عينة. سيقوم أخصائي الأنسجة أو أخصائي علم الأمراض بفحص العينة الفعلية وملاحظة الأبعاد والشكل واللون وأي تفاصيل قد تحتوي عليها العينة. تتكرر هذه الخطوة أثناء خطوة حساب الإجمالي لملاحظة أي قطع تم إجراؤه بواسطة أخصائي الأنسجة أو مساعد أخصائي علم الأمراض وملاحظة ما يتم تقديمه للمعالجة أو التجميد.

      الإجمالي هو الخطوة التي تجعل العينة مقطوعة بشكل كبير للأنسجة. تأتي العلب بأحجام مختلفة ، لذلك يتم اختيار حجم الكاسيت الصحيح أثناء هذه الخطوة أيضًا. يكون الكاسيت ذو الحجم الشائع أفضل إن أمكن ، لكن في بعض الأحيان لن يكون كبيرًا بما يكفي لعينات مثل مقل العيون أو بيض السلاحف. العينات التي لا ينبغي قطعها فقط لتناسب شريط كاسيت! بالنسبة للعينات التي سيكون لها هامش جراحي للتحقق ، غالبًا ما يتم تقسيم هذه الهوامش إلى أشرطة مختلفة. غالبًا ما يحدد الجراح جوانب العينة ويمكن فحص كل جانب محدد بواسطة أخصائي علم الأمراض.

      تتم معالجة العينة عادةً بإحدى الطرق الثلاث:

      لكل خطوة من هذه الخطوات رقم الإجراءات بالآلاف. ستتم مناقشة الإجراء القياسي لعينات الحجم العادي لكل منها. ضع في اعتبارك أنه كلما كبرت العينة ، زادت مدة كل خطوة في الإجراء. إذا كانت العينة صغيرة ، فستكون كل خطوة أقصر. توقع زيادة الخطوات مثلما تمت مناقشته للتثبيت. تريد نسبة 1 إلى 15 من الأنسجة إلى محلول التثبيت ، وبالمثل تريد هذه الحصة لمعالجة العينات. إذا قمت بتحميل الماكينات أكثر من اللازم ، أو الحاويات في حالة المعالجة اليدوية ، فسيكون للأنسجة نتائج مروعة وستستغرق وقتًا إضافيًا وعناية في الخطوات التالية. يؤدي هذا إلى إبطاء سير العمل في المختبر ولن يسعدك جميع أصدقائك في علم الأنسجة والأمراض إذا قمت بذلك. إذا لم تتم معالجة الكتل بشكل صحيح ثم تحتاج إلى قطعها بعد عام أو عامين ، فقد لا يكون لديك تفاصيل عن الأغشية أو النوى ، كما أنها قد لا تلوث بـ IHC!

      معالجة البارافين هي أكثر إجراءات الأنسجة شيوعًا. في جميع المختبرات ، ربما يكون هذا الإجراء هو الإجراء الوحيد الذي يقوم به كل مختبر بشكل متماثل تقريبًا. إذا تعلمت ذلك بمجرد عدم وجود مشكلة عند الانتقال من معمل إلى آخر ، فيمكنك دائمًا الحصول على الخبرة في هذا الجزء من علم الأنسجة. إذا كنت طالب علم الأنسجة ، أو طالب علم الأمراض ، فهذا شيء يجب أن تتعلمه لتجنب الصعوبة عند تشغيل المعالج. تقوم الشركات المصنعة المختلفة بتصميم معالجات بشكل مختلف ، وستحاول لوحة التحكم دائمًا أن تكون أكثر براقة وسهولة في الاستخدام مع بيع طرز جديدة ، ولن يمنحك أي من هذه الأجهزة نتائج أفضل. المعالجة اليدوية هي أفضل طريقة للمعالجة وأفضلها ، على الرغم من أن المعدات باهظة أكثر من المعالج البسيط. تعتبر المعالجة اليدوية أمرًا خطيرًا ويجب التعامل معه على أنه خطر حقيقي على السلامة. لن يواجه الخبير مشكلة ، ولكن يجب تدريب أخصائي الأنسجة الجديد ومراقبته قبل إجراء المعالجة اليدوية وحدها. ما يقرب من 100 في المائة من جميع المعامل لا تقوم بالمعالجة اليدوية. إنه قديم الطراز ويستغرق عددًا كبيرًا من ساعات العمل الفني. فقط المختبر الذي يتمتع بسير عمل ممتاز يمكنه معالجة العملية. لهذا السبب ، وحقيقة أن العديد من مختبرات الأنسجة تعاني باستمرار من نقص في عدد العاملين في المستشفيات ، فإن المعالجات الآلية هي المفضلة لأخصائي الأنسجة وعلم الأمراض في كل مكان.

      المعالجات عبارة عن آلات يجب أن تعالج الأنسجة ثم تنظف نفسها. الكواشف في هذه الآلات هي عادة & # 8212 الفورمالين والكحول والزيلين والبارافين. تستخدم بعض المعامل بدائل لهذه الخطوات ، لأسباب مختلفة مثل السلامة ، والتخلص من النفايات ، والتكلفة ، والوقت ، ومواصفات الشركة المصنعة للمعالج ، وأنواع الأنسجة ، وتفضيلات درجة حرارة الانصهار ، واحتياجات إزالة الكلس ، والاحتياجات الخاصة بالأنواع ، والعديد من الأسباب الأخرى. تتعلق الخطوات الأساسية للفورمالين والكحول والزيلين والبارافين بالاحتياجات الأساسية للمعالجة. هذه الاحتياجات هي على النحو التالي & # 8211 التثبيت والجفاف والتسلل. التثبيت يحافظ على الأنسجة. يزيل الجفاف كل الماء من الأنسجة. يعتبر التسلل هو الجزء الأكثر تعقيدًا في المعالجة ، وفي حالة البارافين يتم إجراؤه عادةً بالزيلين متبوعًا بالبارافين. يمكن أن يختلط الزيلين مع كل من الكحول والبارافين ولهذا السبب تم اختياره. ليس لها أي غرض آخر. بدائل الزيلين موجودة منذ سنوات عديدة حتى الآن ، وما زالت العديد من المعامل تفضل الزيلين. الزيلين قابل للاشتعال وهو سم عصبي ، ولا يظهر هذا على أنه خطر بالطريقة التي يستخدمها أخصائي الأنسجة. في السنوات الأخيرة ، تم التركيز على السلامة في معظم المعامل وتم وضع بروتوكولات جديدة لضمان بيئة عمل آمنة.

      بعد معالجة التضمين هي الخطوة التالية في علم الأنسجة. يعد التضمين خطوة مهمة وحساسة للوقت. يتضمن تضمين البارافين استخدام آلات التضمين والألواح الباردة. آلات التضمين عبارة عن موزعات البارافين مع حاويتين كبيرتين دافئتين للعينات والقوالب. الألواح الباردة ، التي يتم ربطها أحيانًا بمحطات الدمج ، عبارة عن ألواح فولاذية مزودة بنظام مضخة تجميد. تعمل الألواح الباردة على تبريد البارافين بسرعة لتسريع عملية التضمين بأكملها.

      عندما تقوم بتضمين أو توجيه شخص آخر للتضمين ، تذكر أن القالب يجب أن يكون دافئًا ، وليس باردًا ، من أجل تقطيع جيد. تريد تجاوز القالب ، والحفاظ على الكاسيت ساخنًا ووضع الكاسيت على القالب قبل أن يتدفق البارافين الفائض من القالب ، وهذا سيضمن أن الكاسيت يثبت البارافين في مكانه جيدًا ولن يحتوي على فقاعات هواء. تتسبب فقاعات الهواء في تدمير الكتل ويمكن أن تتسبب في خفض المستويات المستقبلية من الكتلة إلى المستويات المبكرة بسبب الحاجة إلى إعادة تضمين العينة بسبب فقاعة الهواء. تتشكل فقاعات هواء صغيرة في أي نسيج به تجويف ، مثل القلب. يمكن ملء هذه التجاويف في معظم الأحيان ، والحرص على القيام بذلك يضمن إجراء الجروح المناسبة.

      نقطة أخرى للتضمين هي إزالة الشمع الزائد من الكتل. تستخدم معظم المعامل الآن صهرًا دافئًا للكتل بزاوية للسماح للبارافين بالتنقيط في الحاوية. سوف يذوب أخصائي الأنسجة الجديد على كتلة في كل مرة ، ويحرص على عدم لمس اللوح الدافئ إلى منطقة قطع الكتلة. قد يذوب أخصائي الأنسجة الأكثر خبرة عدة مرات في وقت واحد لتوفير الوقت. لا تؤثر هذه التقنية على القطع ، ولكن أكبر أحجام الكتل لن يتم صهرها بنسبة 100٪ في وجه الكتلة الزاوية حيث تتم كتابة بيانات معرف الكتلة. لهذا السبب ، غالبًا ما يتم تنظيف سطح الكتابة مرة أخرى أثناء القطع باستخدام تقنيات أكثر خبرة.

      من هذه النقطة في دليل الدراسة ، سيتم استخدام لغة الأنسجة. إذا كنت لا تعرف ما يعنيه المصطلح في هذا الوقت ، فسيتم تضمين مسرد في نهاية الدليل.

      حاجز& # 8211 عينة مضمنة جاهزة للقطع ، وغالبًا ما تحتوي على جزأين ، يتم إرفاق شريط بها لتلائم مشراح وأغراض وضع العلامات. بالنسبة للتجميد ، يمكن أن يعني هذا أيضًا تضمين قطعة من الأنسجة المجمدة.

      الإجمالي& # 8211 العينة التي يتم فحصها وتسجيلها

      علم الانسجة& # 8211 دراسة الأنسجة.

      تقنية النسيج& # 8211 علم المختبر لتحضير الأنسجة للفحص المجهري.

      H & ampE- وصمة تظهر تفاصيل الخلية ، نوى متناقضة من السيتوبلازم. هذه هي البقع الأكثر شيوعًا في العالم للأنسجة. يرمز H & ampE إلى & # 8220Hematoxylin و Eosin & # 8221. عادة ما تتبع هذه البقعة بروتوكولات مماثلة مع تباين ملحوظ هو إضافة الفلوكسين إلى Eosin. يصبغ الفلوكسين لونًا أحمر عميقًا على بعض مكونات الأنسجة ويفضل من قبل بعض الأطباء. الهيماتوكسيلين عبارة عن كاشف يتم تحضيره بعناية كبيرة ويحتاج إلى وقت لينضج خلال المرحلة الأخيرة من التحضير. تمت مقارنة هذه العملية بصنع النبيذ ، على الرغم من أنها في الواقع مهمة تستغرق وقتًا أقل بكثير ، ولا يمكنك شربها. يتم دائمًا تصفية الهيماتوكسيلين ويوزين وقبل الاستخدام الأول.


      شاهد الفيديو: منظومه أنفاق تجميد 40 (يونيو 2022).


تعليقات:

  1. Aldrick

    هل يمكن إعادة صياغة هذا؟

  2. Jarmann

    تعلم القراءة

  3. Sumerton

    قراء مدونتي سيكونون مهتمين بهذا هل يمكنني عمل مشاركة متبادلة على مدونتي؟

  4. Taye

    أعتذر ، لكن هذا الخيار لم يكن مناسبًا بالنسبة لي.

  5. Michel

    في رأيي ، يتم ارتكاب الأخطاء. دعونا نحاول مناقشة هذا. اكتب لي في PM.

  6. Eames

    مبروك ، فكرة رائعة والإطار الزمني



اكتب رسالة