معلومة

تلطيخ الخلايا لـ FACS عند 4 درجات أو درجة حرارة الغرفة

تلطيخ الخلايا لـ FACS عند 4 درجات أو درجة حرارة الغرفة


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أقوم بفرز خط مشتق 293. الشيء الوحيد الذي يقلقني هو قابلية الخلية للحياة بعد هذا النوع. عادة ما كنت أقوم بالتلوين والغسيل في درجة حرارة الغرفة (على المنضدة) على الجوز. لقد قرأت أن معظم إجراءات الفرز تشير إلى أنه يجب عليك القيام بذلك بأربع درجات في الظلام. أفهم أن هذا يساعد في التكتل ، لكن هل هذا على حساب الجدوى؟ هل البرد يسبب موت هذه الخلايا؟

الإجراء الخاص بي حاليًا هو التالي -

باستخدام HBSS + 1 ملي EDTA + 1٪ BSA (مخزن مؤقت للفرز) أعلق حوالي 10-15 مليون خلية لكل / مل.

  • وصمة عار مع الابتدائية

  • تدور بسرعة 300 × جم لمدة 5 دقائق

  • أضف 15 مل من المخزن المؤقت للفرز ، ثم قم بالتدوير مرة أخرى

  • وصمة عار مع الثانوية في 1 مل من نوع المخزن المؤقت

  • اغسل x2 بـ 15 مل

  • أضنى

  • نوع

شيء واحد يمكنني القيام به لتقليل موت الخلايا هو عمل وصمة عار حية / ميتة (لقد أضفنا هذه القدرة للتو). الشيء الآخر الذي قرأته هو استخدام FBS بنسبة 50٪ في أنبوب التجميع الخاص بك.

الشيء الآخر الذي قد يكون مصدر قلق هو أنه إذا قمنا بالعديد من الأنواع ، فقد تكون بعض الأنابيب موجودة في مخزن مؤقت للفرز لفترة طويلة في قائمة الانتظار. ما هي مدة طويلة جدا؟

أخيرًا ، نستخدم البوروميسين والبلاستيدين كعلامات اختيار لمكتباتنا وعادةً ما نضيف هذه العلامات إلى الفرز بعد الاستبدال. هل يجب أن ننتظر بعض الوقت؟

شكرا على النصيحة


لديك عدة أسئلة ، يرجى محاولة قصر مشاركاتك على سؤال واحد لكلٍّ منها. بعد قولي هذا ، سأحاول معالجة كل مخاوفك.

هل البرد يسبب موت هذه الخلايا؟

لا ، إن الغرض من التلطيخ عند 4 درجات مئوية والغسيل باستخدام المخزن المؤقت البارد مزدوج - للحفاظ على الصلاحية (تتباطأ جميع العمليات الخلوية عند درجات الحرارة المنخفضة) ولمنع استيعاب المستقبلات. هذه النقطة الثانية مهمة بشكل خاص لأنك تستخدم ثانويًا أساسيًا ومترافقًا ، والذي لا أوصي به حقًا للفرز ما لم يكن ذلك ضروريًا للغاية ، على سبيل المثال إذا لم يكن الجسم المضاد الذي تستخدمه متاحًا بتنسيق مترافق بشكل مباشر.

شيء واحد يمكنني القيام به لتقليل موت الخلايا هو عمل وصمة عار حية / ميتة (أضفنا هذه القدرة للتو).

تعتبر البقع الحية / الميتة فكرة جيدة بشكل عام ، ولكن تأكد من أن البقعة التي تستخدمها ليست سامة للخلايا. يجب أن يكون L / D دائمًا آخر خطوة تلطيخ قبل تشغيل العينات. أفضل طريقة (إذا كان جهاز الفرز الخاص بك يدعمه) هو استخدام قياسات الارتفاع والتشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) لتمييز الخلايا الفردية ذات الحجم المناسب ، ثم قم بالبوابة عليها أولاً قبل تحديد بقعة الجسم المضاد (FITC) أو PE أو أيًا كان ما هو ثانوي).

الشيء الآخر الذي قرأته هو استخدام FBS بنسبة 50٪ في أنبوب التجميع الخاص بك.

لست متأكدًا من مقدار المساعدة ، خاصةً 293s ، وهي صعبة جدًا. فقط تأكد من تخفيف الخلايا المجمعة بدرجة كافية في المتوسط ​​لتقليل نسبة المصل إلى 10٪.

إذا كنا نقوم بالعديد من الأنواع ، فقد تكون بعض الأنابيب موجودة في مخزن مؤقت للفرز لفترة طويلة في قائمة الانتظار. ما هي مدة طويلة جدا؟

طالما يتم الاحتفاظ بالعينات الخاصة بك في الظلام على الجليد أو عند 4 درجات مئوية ، يجب أن تكون على ما يرام لعدة ساعات على الأقل (لن أذهب بين عشية وضحاها). تأكد أيضًا من تبريد وسيط التجميع الخاص بك ، حيث يمكن أن يصدم الخلايا لتنتقل من 4 درجات إلى 37 درجة بسرعة كبيرة. اجمع عينتك ، وطبقها ، ثم ضعها في درجة حرارة الغرفة أو في الحاضنة (اعتمادًا على سير عملك) واتركها تدفأ بهذه الطريقة.

أخيرًا ، نستخدم البوروميسين والبلاستيدين كعلامات اختيار لمكتباتنا وعادةً ما نضيف هذه العلامات إلى الفرز بعد الاستبدال. هل يجب أن ننتظر بعض الوقت؟

لا تقلق بشأن ذلك. يمكنك الانتظار إذا أردت ، أو إضافته على الفور - سأميل نحو إضافته بسرعة أكبر من عدمه ، حتى لا تمنح الخلايا غير المرغوب فيها أي فرصة للنمو.


حاضنة EVOS Onstage

يسمح خيار EVOS Onstage Incubator (المتوافق مع أنظمة M7000 و M5000) بتصوير وتحليل الخلايا الحية دون إزالتها من الحاضنة. يتيح ذلك التحكم الدقيق في درجة الحرارة والرطوبة وثلاثة غازات للتصوير بفاصل زمني للخلايا الحية في ظل الظروف الفسيولوجية وغير الفسيولوجية. يتم دمج جميع الإعدادات البيئية ومعلمات الحصول على الصور بسلاسة في واجهة البرنامج ، مما يؤدي إلى إنشاء نظام تصوير مقلوب عالي الأداء يتمتع بمرونة لا مثيل لها ، وسهولة في الاستخدام ، وبصريات للمطالبة بتجارب تصوير مضان بفاصل زمني.

معًا ، يتيح نظام التصوير EVOS M7000 أو M5000 وحاضنة EVOS Onstage للباحثين مراقبة التغيرات في التشكل الخلوي بمرور الوقت وتحديد صحة الخلايا ووظائفها ونشاطها في ظل ظروف فسيولوجية خاضعة للرقابة. يصعب الحصول على مثل هذه البيانات الحركية الزمنية على المستوى الخلوي باستخدام حلول التصوير التقليدية.


تقنية

قم بتنزيل شهادة التحليل

شحن المنتج وتخزينه وعمره التخزيني وقابليته للذوبان

مجموعات العلوم البيولوجية
مدة الصلاحية المضمونة من تاريخ استلام مجموعات العلوم البيولوجية مدرجة في ورقة معلومات المنتج. تحتوي بعض المجموعات على تاريخ انتهاء صلاحية مطبوع على ملصق صندوق الأدوات ، وهذا هو تاريخ الصلاحية المضمون المحسوب من يوم شحن المنتج من منشأتنا. غالبًا ما تكون المجموعات فعالة لفترة أطول بكثير من مدة الصلاحية المضمونة. إذا كان لديك مجموعة قديمة في التخزين وترغب في استخدامها ، فإننا نوصي بإجراء تجربة تحكم إيجابية على نطاق صغير للتأكد من أن المجموعة لا تزال تعمل لتطبيقك قبل معالجة عدد كبير من العينات أو العينات الثمينة.

الأجسام المضادة والمقارنات الأخرى
يتم سرد مدة الصلاحية المضمونة من تاريخ استلام الأجسام المضادة والمقترنات في ورقة معلومات المنتج. غالبًا ما تكون الأجسام المضادة والمقترنات الأخرى وظيفية لفترة أطول بكثير من مدة الصلاحية المضمونة. إذا كان لديك متقارن أقدم في التخزين ترغب في استخدامه ، فإننا نوصي بإجراء تجربة تحكم إيجابية على نطاق صغير للتأكد من أن المنتج لا يزال يعمل لتطبيقك قبل معالجة عدد كبير من العينات أو العينات الثمينة.

بالنسبة للأجسام المضادة المجففة بالتجميد ، نوصي بإعادة تكوين الجسم المضاد باستخدام الجلسرين والمواد الحافظة المضادة للميكروبات مثل أزيد الصوديوم لأطول فترة صلاحية (لاحظ أن أزيد الصوديوم غير متوافق مع اقتران HRP).

المواد الكيميائية والأصباغ والبقع الجل
يضمن Biotium استقرار المواد الكيميائية والأصباغ والبقع الهلامية لمدة عام على الأقل من تاريخ استلام المنتج. ومع ذلك ، فإن غالبية هذه المنتجات مستقرة للغاية لسنوات عديدة ، طالما يتم تخزينها على النحو الموصى به. يمكن العثور على شروط التخزين في ورقة معلومات المنتج أو ورقة بيانات وسلامة المنتج ، ورقة بيانات سلامة المواد ، وعلى ملصق المنتج. يجب حماية المركبات الفلورية من الضوء للتخزين طويل الأمد.

إذا كان لديك مركب Biotium تم تخزينه لمدة تزيد عن عام واحد وترغب في استخدامه ، نوصي بإجراء تجربة تحكم إيجابية على نطاق صغير للتأكد من أن المركب لا يزال يعمل للتطبيق الخاص بك قبل معالجة عدد كبير من العينات أو الثمينة عينات.

تاريخ انتهاء الصلاحية على أساس تاريخ الصنع (DOM)
إذا طلبت منك مؤسستك توثيق تاريخ انتهاء الصلاحية بناءً على تاريخ تصنيع الكواشف ، فيرجى الاتصال على [email protected] للحصول على المساعدة.

المنتجات الكيماوية ذات اعتبارات الاستقرار الخاصة:

تشمل مركبات استر ما يلي:
• استرات Succinimidyl (SE ، والمعروفة أيضًا باسم إسترات NHS) ، مثل الأصباغ التفاعلية الأمينية
• إسترات أسيتوكسي ميثيل (AM esters) مثل أصباغ مؤشر الأيونات المنفصلة بالغشاء
• الأصباغ المعدلة من الأسيتات ، مثل ViaFluor ™ 405 و CFDA و CFDA-SE وأصباغ تكاثر الخلايا

أصباغ الإستر ثابتة في شكلها الصلب طالما أنها محمية من الضوء والرطوبة. الاسترات ليست مستقرة في محلول مائي. يجب تحضير محاليل المخزون المركزة في DMSO اللامائي (انظر كتالوج Biotium رقم 90082). يمكن تخزين محاليل المخزون في DMSO اللامائي مجففة عند -20 درجة مئوية لمدة شهر واحد أو أكثر. يجب تخفيف الإسترات في محلول مائي مباشرة قبل الإستعمال. يجب إذابة استرات Succinimidyl (SE) في محلول خالٍ من المركبات المحتوية على أمين مثل Tris أو glycine أو البروتين ، والتي ستتفاعل مع المجموعة الوظيفية SE. يجب إذابة استرات AM ومركبات الأسيتات في محلول خالٍ من المصل ، لأن المصل يمكن أن يحتوي على إسترات من شأنها أن تحلل المركب بالماء.

ملاحظة على ثبات استر سكسينيميديل صبغة CF ™
استرات Succinimidyl بشكل عام عرضة للتحلل المائي ، مما قد يؤدي إلى انخفاض كفاءة وضع العلامات. الأصباغ كثيفة المسلفنة ، مثل أصباغ Alexa Fluor® ، أصباغ DyLight® و IRDyes® هي أصباغ استرطابية بشكل خاص ، مما يؤدي إلى تفاقم مشكلة التحلل المائي. على سبيل المثال ، يمكن أن تكون النسبة المئوية لـ Alexa Fluor® 488 succinimidyl ester (SE) أقل بكثير من 50٪ بحلول وقت التطبيق (وفقًا لورقة بيانات المنتج الخاصة بالشركة المصنعة). في عدد من أصباغ Alexa Fluor® SE التفاعلية ، يتم اشتقاق مجموعة SE من حمض الكربوكسيل العطري ، بينما في جميع أصباغ Biotium's CF ™ ، يتم تحضير مجموعة SE من حمض كربوكسيل أليفاتي. يقلل هذا الاختلاف الهيكلي من قابلية المجموعات التفاعلية SE لصبغة CF ™ للتحلل المائي ، مما ينتج عنه أصباغ تفاعلية مستقرة نسبيًا مع كفاءة وضع علامات أعلى باستمرار مقارنة بمشتقات SE الأخرى لأصباغ الفلورسنت الأخرى.

أصباغ مالييميدات ، MTS وثيوسلفات
مثل أصباغ استر succinimidyl ، فإن هذه الأصباغ أيضًا عرضة للتحلل المائي ، على الرغم من أنها بدرجة أقل بشكل عام. وبالتالي ، للتخزين طويل الأجل ، يوصى باستخدام DMSO اللامائي لصنع حلول المخزون.

الأصباغ التفاعلية الأخرى
تكون الأمينات ، والأمينوكسي (المعروف أيضًا باسم أوكسي أمين) ، والهيدرازيد ، والأزيد ، والألكين ، و BCN ، والأصباغ التفاعلية التيراميد ، وكذلك الأحماض الخالية من الصبغة ، ثابتة بشكل عام في محلول مائي عند تخزينها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 6-12 شهرًا أو أكثر ، طالما لا توجد مركبات قد تتفاعل مع المجموعة الوظيفية للصبغة. راجع أوراق معلومات المنتج للحصول على أصباغ تفاعلية محددة مزيد من المعلومات.

Coelenterazines و D- لوسيفيرين

تكون Coelenterazines مستقرة في شكل صلب عند تخزينها على النحو الموصى به فهي غير مستقرة في محلول مائي. يجب تحضير محاليل مخزون coelenterazine المركزة (عادةً 1-100 مجم / مل) في الإيثانول أو الميثانول لا تستخدم DMSO أو DMF لإذابة الكولينتيرازين ، لأن هذه المذيبات ستؤكسد المركبات. يمكن تخزين مخزون الإيثانول أو الميثانول من coelenterazine في درجة حرارة -20 درجة مئوية أو أقل لمدة ستة أشهر أو قد يتبخر مخزون الكحول لفترة أطول أثناء التخزين ، لذلك استخدم قوارير ذات أغطية لولبية محكمة الغلق ولف القوارير باستخدام Parafilm للتخزين طويل الأجل. يمكن أيضًا استخدام البروبيلين جليكول كمذيب لتقليل التبخر. إذا تبخر المذيب ، فسيظل الكولينترازين موجودًا في القارورة ، لذا لاحظ الحجم في القارورة قبل التخزين حتى تتمكن من ضبط حجم المذيب لتصحيح التبخر إذا لزم الأمر. تحضير محاليل العمل في المحاليل المائية قبل الاستخدام مباشرة. تكون مركبات Coelenterazines مستقرة لمدة تصل إلى خمس ساعات في محلول مائي.

Coelenterazines Aquaphile ™ هي تركيبات قابلة للذوبان في الماء من coelenterazines. إنها مستقرة في شكل صلب عند تخزينها على النحو الموصى به. يجب إذابة Aquaphile ™ coelenterazines في محلول مائي مباشرة قبل الاستخدام. وهي مستقرة لمدة تصل إلى خمس ساعات في محلول مائي.

لاحظ أن coelenterazines عبارة عن مواد صلبة صفراء في الغالب ، ولكنها قد تحتوي على بقع حمراء أو بنية داكنة. هذا لا يؤثر على استقرار المنتج أو الأداء. إذا كان الكويلنتيرزين الخاص بك بنيًا بشكل موحد ، فإنه يتأكسد ويحتاج إلى الاستبدال.

يكون D-luciferin مستقرًا في شكل صلب وكمحلول مخزون مركّز عند تخزينه على النحو الموصى به فهو غير مستقر عند تركيزات العمل المخفف في محلول مائي. تحضير محاليل مخزون D-luciferin المركزة (عادة 1-100 مجم / مل) في الماء ، وتخزينها في قسامات عند -20 درجة مئوية أو أقل لمدة ستة أشهر أو أكثر. تحضير حلول العمل مباشرة قبل الاستخدام.

معظم منتجاتنا مستقرة في درجة حرارة الغرفة لعدة أيام ، لكننا نوصي بالتخزين عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية لإطالة العمر الافتراضي. في حالة العديد من محاليل الصبغة المائية لدينا ، تكون المركبات مستقرة جدًا في درجة حرارة الغرفة ، لكننا نوصي بالتخزين البارد لمنع نمو العفن أو الميكروبات الأخرى بمرور الوقت. لذلك ، لتوفير تكاليف الشحن ، قد يتم شحن المنتجات ذات التخزين الموصى به عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية في درجة حرارة الغرفة أو مع علبة ثلج. قد تذوب هذه المنتجات دون التأثير على أداء المنتج. عندما تتلقى المنتج ، ضعه في ظروف التخزين الموصى بها.

معظم منتجاتنا مستقرة في درجة حرارة الغرفة لعدة أيام ، لذلك في جميع الاحتمالات ، سيظل المنتج يعمل بشكل جيد. لكي تكون في الجانب الآمن ، نوصي بإجراء تجربة تحكم إيجابية على نطاق صغير للتأكد من أن المنتج لا يزال يعمل لتطبيقك قبل معالجة عدد كبير من العينات أو العينات الثمينة.

أحد الاستثناءات التي ندركها هو GelGreen ™ ، وهو أكثر حساسية للتعرض للضوء من معظم أصباغ الفلورسنت الأخرى. إذا تعرض GelGreen ™ للضوء المحيط لفترة طويلة من الوقت (أيام إلى أسابيع) ، سيتغير لونه من البرتقالي الداكن إلى الأحمر القرمزي. في حالة حدوث ذلك ، لن يعمل GelGreen بعد الآن من أجل تلطيخ الجل.


نتائج

يؤدي تبريد الدم قبل المعالجة إلى المساس بالصلاحية ويغير تكوين مجموعات فرعية من PBMC المستردة

شرعنا في البداية في تقييم تأثير التأخير في معالجة الدم المبرد. تمت معالجة العينات بعد التخزين عند 4 & # x000b0C لمدة 6 أو 12 أو 24 ساعة ، أو تمت معالجتها حديثًا (خلال ساعتين من سحب الدم). تم حفظ جميع PBMCs بالتبريد في & # x0221280 & # x000b0C ، ثم تم إذابتها لتحليل التدفق الخلوي الفلوري (الشكل 1). انخفض تواتر الخلايا القابلة للحياة كما هو محدد بواسطة تلطيخ صبغة NIR مع التخزين عند 4 & # x000b0C ، مع وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين عنصر التحكم وكلا المجموعتين 6 و 24 ساعة (الشكل 1 أ). أظهرت مجموعات الخلايا الفردية تأثيرات تفاضلية للتخزين البارد لخلايا CD3 + CD4 + T وانخفضت ، وزادت الخلايا الليمفاوية CD3 & # x02212 (الخلايا B و NK) ، ولم تتغير خلايا CD3 + CD4 & # x02212. كان هناك أيضًا اتجاه غير مهم نحو تقليل نسبة الخلايا الأحادية ، التي تم تحديدها على أنها CD4 lo CD14 + (الشكل 1 B & # x02013E). تؤكد هذه البيانات أنه عند تخزينها في ظروف مبردة ، يمكن أن يؤثر التأخير في وقت المعالجة بشكل كبير على مجموعات PBMC الموجودة في العينات المحفوظة بالتبريد.

تم جمع ما مجموعه 4 & # x000d7 5 مل من أنابيب الدم EDTA من كل من خمسة متبرعين. تمت معالجة الأنابيب على الفور أو تبريدها لمدة 6 أو 12 أو 24 ساعة قبل المعالجة. تم حفظ جميع PBMCs بالتبريد وتم إذابتها لاحقًا وتقييمها عن طريق قياس التدفق الخلوي الفلوري لـ FSC و SSC للتمييز بين الخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية ، والتعبير عن CD3 و CD4 و CD14. (أ) تم تحديد الجدوى باستخدام صبغة قابلية NIR ، مع إظهار المخططات النقطية التمثيلية التغييرات في التشتت الأمامي مقابل الجدوى بمرور الوقت. داخل الخلايا القابلة للحياة ، (ب) حيدات على أنها CD4 lo CD14 + وتم تأكيد هويتها بواسطة FSC / SSC ، (ج) تم تحديد بوابات الخلايا B و NK بشكل جماعي كخلايا لمفاوية سلبية CD3 ، (د) تم إغلاق خلايا CD4 + T كـ CD3 + CD4 + و (ه) تم تحديد خلايا CD8 + T في هذه اللوحة المحدودة على أنها CD3 + CD4 & # x02212. تم تحليل البيانات باستخدام مقاييس متكررة أحادية الاتجاه ANOVA مع اختبارات Tukey & # x02019s اللاحقة و ص تظهر القيم التي تشير إلى اختلافات كبيرة بين النقاط الزمنية.

تنخفض استعادة الخلايا عندما يتم تبريد الدم قبل المعالجة

سعينا بعد ذلك إلى فهم مراحل بروتوكول معالجة الدم التي ساهمت في هذه التغييرات في الجدوى واستعادة المجموعة الفرعية ، وما إذا كانت هذه التغييرات واضحة أيضًا في العينات المخزنة في RT قبل المعالجة. تم تحديد استرداد الخلايا من خلال مقارنة عدد كرات الدم البيضاء المستردة من فصل التدرج اللوني Ficoll-hypaque مع الرقم الذي تم تحميله على التدرج اللوني ، كما هو محدد من عدد كرات الدم البيضاء قبل التدرج. في RT ، لوحظ انخفاض طفيف فقط في عدد WBC السابق لـ Ficoll (12 ٪ خلال 24 ساعة) ، كان فقدان 25 ٪ واضحًا مع 24 ساعة من التخزين البارد. بعد المعالجة ، لوحظ خسارة أكبر بكثير من كرات الدم البيضاء في أوقات التبريد لمدة 6 ساعات (62٪) و 24 ساعة (74٪) ، في حين أن الزيادة الصغيرة للعينات المخزنة في RT لم تصل إلى دلالة إحصائية (الشكل 2 أ). استجابة للتبريد ، لاحظنا تكوين العديد من كتل الخلايا التي تحتوي على كريات الدم الحمراء ، والتي لم يتم الاحتفاظ بها في واجهة الكثافة أثناء عزل PBMC (غير معروض) ، وهذا قد يفسر ضعف استرداد WBC. أظهر انتعاش الخلايا الليمفاوية نفس الاتجاهات (الشكل 2 ب). توضح هذه الملاحظات أن التبريد قلل بشكل سلبي من استرداد WBC.

تم جمع ما مجموعه 5 & # x000d7 7 مل من أنابيب الدم الهيبارين من كل من المتبرعين السبعة ، و 2 & # x000d7 7 مل من أنابيب الدم الهيبارين من متبرع إضافي. تمت معالجة الأنابيب الفردية إما على الفور أو الاحتفاظ بها في RT أو 4 & # x000b0C لمدة 6 أو 24 ساعة. تم تحليل PBMCs وقسمة الدم الكامل باستخدام محلل الدم الآلي Sysmex XP-300 & # x02122. تم تحليل تعداد الدم الكامل باستخدام ANOVA ذات التأثيرات المختلطة أحادية الاتجاه مع اختبارات Tukey & # x02019s اللاحقة. شوهد انخفاض صغير في WBC مع تخزين RT (5 ٪ في 6 ساعات ، 11 ٪ في 24 ساعة ، ص= 0.04) وانخفاض أكبر عند 4 & # x000b0C (12٪ عند 6 ساعات ص= 0.003 ، 25٪ عند 24 ساعة ص= 0.002). بالنسبة للمتبرع الإضافي ، تم إجراء تحليلات RT 0 و 24 ساعة فقط. استعادة الخلايا من (أ) WBC و (ب) تم حساب الخلايا الليمفاوية كنسبة مئوية من رقم الخلية المحملة على تدرج Ficoll-hypaque. ترجع القيم المفقودة للخلايا الليمفاوية إلى عدم قدرة Sysmex على حل ذروة الخلايا الليمفاوية المميزة. تم تحليل البيانات باستخدام تأثيرات مختلطة أحادية الاتجاه ANOVA مع اختبارات Tukey & # x02019s اللاحقة و ص تظهر القيم التي تشير إلى اختلافات كبيرة بين النقاط الزمنية. بالنسبة لتحليل 4 & # x000b0C ، تم الحصول على عدد الخلايا الليمفاوية لمدة 24 ساعة لعينة واحدة فقط ، لذلك تم تحليل النقاط الزمنية 0 و 6 ساعات باستخدام قيم مقترنة ر اختبار.

يؤدي تخزين RT للدم الكامل إلى تلوث العدلات من PBMCs ولكن لا توجد تغييرات في توزيع المجموعات الفرعية للخلايا الرئيسية

نظرًا لأن استرداد WBC تم تقليله بشكل ملحوظ عن طريق التبريد ، فقد قصرنا المزيد من التحليل على تأثيرات تخزين RT. استخدمنا قياس التدفق الخلوي الفلوري لتقييم التغيرات في التركيب الخلوي للدم الكامل و PBMCs بعد 6 و 24 ساعة RT. كان هناك انخفاض طفيف في نسبة العدلات في الدم الكامل ، في حين أن نسبة العدلات في PBMCs زادت بشكل ملحوظ بعد تخزين RT (الشكل 3 أ ، ب). تم تأكيد تحديد التدفق الخلوي للعدلات عن طريق التشتت الجانبي والتعبير عن CD16 تشريحياً من خلال تحديد العدلات متعددة النواة في صور الطرد المركزي الخلوي (الشكل 3 C & # x02013E).

تم جمع ما مجموعه 3 & # x000d7 5 مل من أنابيب الدم الهيبارين من كل من خمسة متبرعين ، وتمت معالجة الأنابيب الفردية إما على الفور أو الاحتفاظ بها في RT لمدة 6 أو 24 ساعة. تم تحليل الدم الكامل و PBMCs عن طريق قياس التدفق الخلوي الفلوري ، باستخدام مزيج من الأجسام المضادة لـ CD3 و CD4 و CD8 و CD56 و CD14 و CD16. تم استبعاد الخلايا الميتة بصبغة صلاحية NIR. تم حساب النسبة المئوية للعدلات ، التي تم تحديدها عن طريق الانتثار الجانبي والتعبير عن CD16 ، داخل الخلايا الحية لـ (أ) دم كامل و (ب) PBMCs. تتم الإشارة إلى كل متبرع بلون مختلف. تم تحليل البيانات باستخدام مقاييس متكررة أحادية الاتجاه ANOVA مع اختبارات Tukey & # x02019s اللاحقة و ص تظهر القيم التي تشير إلى اختلافات كبيرة بين النقاط الزمنية. (ج& # x02013ه) كانت قسامات من PBMCs عبارة عن cytospun ، ملطخة بـ Giemsa المعدلة وتم تصويرها. تشير الأسهم الخضراء إلى العدلات ذات التشكل النووي الناضج النموذجي في عينات 6 و 24 ساعة.

بالنسبة لمجموعات الخلايا الرئيسية الأخرى (الخلايا الوحيدة والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا البائية والخلايا التائية ومجموعاتها الفرعية CD4 و CD8 T) ، لم يكن للتخزين في RT تأثير كبير على تمثيلها داخل الجزء غير العدلات من الدم الكامل أو PBMCs ( الشكل 4). وبالمثل ، كشف تقييم الجدوى باستخدام Zombie NIR عن عدم وجود تغييرات ناتجة عن تخزين RT. في الدم الكامل ، كانت جميع العينات أكثر من 99.4 ٪ قابلة للحياة ، وفي PBMCs كانت أقل جدوى مسجلة 98.6 ٪ (البيانات غير معروضة). توضح هذه البيانات أن تأخير معالجة الدم لفترة طويلة من الوقت يؤدي إلى تلوث العدلات في مستحضرات PBMC.

تم تحليل البيانات من التجربة الموصوفة في الشكل 3 لتحديد النسبة المئوية لمجموعات الخلايا الفرعية الرئيسية ، معبراً عنها كنسبة من كرات الدم البيضاء غير العدلة لحساب تأثير تلوث العدلات منخفض الكثافة في عينات 6 و 24 ساعة. (أ) إجمالي خلايا CD3 + T ، (ب) خلايا CD56 + NK ، (ج) حيدات ، بوابات للتشتت الجانبي وتعبير CD14 ، (د) خلايا CD19 + B ، (ه) خلايا CD4 + T و (F) خلايا CD8 + T. كشفت المقاييس المتكررة أحادية الاتجاه ANOVA عن عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين النقاط الزمنية لأي من مجموعات الخلايا الفرعية.

تنفيذ القياس الخلوي الشامل لتحليل النمط المناعي الشامل

تشير نتائج التحليل الخلوي لتدفق التدفق الخلوي لعينات الدم المخزنة في RT إلى أن التأخير لمدة 24 ساعة قبل المعالجة سيكون له تأثير ضئيل على النمط المناعي الواسع. ومع ذلك ، فإن نوع التوقيع المناعي الذي يتم فحصه بشكل متزايد في مرضى السرطان يتضمن عددًا كبيرًا من مجموعات الخلايا الفرعية الأصغر التي لم يتم فحصها في تحليل التألق. تم حفظ قسامات عينات PBMC من التجارب الموضحة في الأشكال 2-4 بالتبريد وتم إذابتها من أجل وقت التحليل الخلوي الكتلي.

أكدت المقارنة بين مجموعات الخلايا الرئيسية التي تم تحديدها عن طريق التحليل الخلوي الشامل لـ PBMCs المحجوزة بالتبريد (الشكل 5) النتائج من تحليل القياس الخلوي الفلوري الذي تم إجراؤه قبل الحفظ الإلكتروني (الشكل 4). كانت أعداد الخلايا الوحيدة و T و NK و B مستقرة ، وكذلك مجموعات فرعية من خلايا CD4 و CD8 T (الشكل 5). أكد تحليل CyTOF للعدلات (الشكل 5 أ) وجود العدلات منخفضة الكثافة داخل PBMCs المعدة بعد تخزين RT.

تم إذابة تجميد PBMCs بالتبريد من التجربة الموضحة في الشكل 3 ، بالإضافة إلى ثلاث جهات مانحة إضافية ، على دفعتين وتحليلها باستخدام القياس الخلوي الكتلي. لكل متبرع ، تم تشفير عينات 0 و 6 و 24 ساعة قبل تلطيخها في أنبوب واحد لضمان تكافؤ ظروف التلوين عبر النقاط الزمنية. كانت البيانات عن بوابات السكان المشار إليها. نتائج عن (أ) يتم التعبير عن العدلات كنسبة من إجمالي الخلايا ، بينما يتم التعبير عن النتائج لمجموعات الخلايا الأخرى (ب & # x02013O) كنسبة من إجمالي الخلايا غير العدلات. تم تحديد بوابات الخلايا Treg كخلايا CD25 + CD127 lo CD4 + T. تم تحديد مجموعات فرعية إضافية من الخلايا التائية للتعبير عن CD45RA و CD45RO و CCR7 في na & # x000efve (CD45RA + CD45RO & # x02212 CCR7 +) ، TCM (CD45RA & # x02212 CD45RO + CCR7 +) ، TEM (CD45RA & # x02212 CD45RO + CCR7 & # x02212) ومجموعات فرعية TEMRA (CD45RA + CD45RO & # x02212 CCR7 & # x02212). يمثل كل لون متبرعًا فرديًا. كشفت المقاييس المتكررة أحادية الاتجاه ANOVA عن عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين النقاط الزمنية لأي من مجموعات الخلايا الفرعية ، بصرف النظر عن العدلات. (ص) تقليل أبعاد tSNE التمثيلي من غير العدلات عبر نقاط زمنية لمتبرع مع زيادة تلوث العدلات بمرور الوقت (المتبرع 3 ، ممثلاً باللون الأخضر الداكن في (A & # x02013O)). تمثل النقاط خلايا فردية ويتم تلوينها حسب المجموعات السكانية في (B & # x02013O).

كشف التحليل الأكثر تفصيلاً للتعبير عن بروتينات سطح الخلية الفردية كما تم الكشف عنها بواسطة قياس الكتلة الخلوية عن انخفاضات تعتمد على الوقت في مجموعة فرعية من العلامات. وشملت هذه المستقبلات الكيميائية CXCR5 و CCR6 و CXCR3 و TIGIT. لتوضيح هذه التغييرات ، تم حساب MSIs لمجموعات الخلايا الفرعية الإرشادية (الشكل 6). ومن المثير للاهتمام أن التعبير عن CD247 (TCR & # x003b6) كان مستقرًا ، على عكس النتائج الواردة في منشور سابق [7].

تم تحليل البيانات من التجربة الموصوفة في الشكل 5 لتحديد تأثير تخزين الدم RT على التعبير عن بروتينات سطح الخلية المكتشفة بواسطة الأجسام المضادة التي تحمل علامات معدنية. لا توجد بروتينات تزيد من التعبير عند 6 أو 24 ساعة. البروتينات التي انخفض تعبيرها بشكل ملحوظ بمرور الوقت ، كما تم تقييمها بواسطة MSI ، موضحة في (أ& # x02013ه). يكون حساب MSI لبيانات قياس الكتلة الخلوية مفيدًا فقط عندما يكون لدى 50٪ على الأقل من أي مجموعة خلايا إشارات يمكن اكتشافها في تلك القناة. لهذا السبب ، يتم عرض مجموعات فرعية من الخلايا ذات تعبير مرتفع نسبيًا عن البروتينات المشار إليها. بالنسبة لـ (A & # x02013C) CXCR5 و CCR6 و TIGIT ، تم تقليل التعبير على جميع مجموعات الخلايا الفرعية ، بينما بالنسبة لـ CXCR3 ، كان هناك تباين بين الخلايا (D) B و (E) CD8 + T الخلايا و (F) حيدات. تم تحليل البيانات باستخدام مقاييس متكررة أحادية الاتجاه ANOVA مع اختبارات Tukey & # x02019s اللاحقة و ص تظهر القيم التي تشير إلى اختلافات كبيرة بين النقاط الزمنية. (ز & # x02013I) لم يظهر التعبير عن CD247 أي تغيير كبير. يتم تحديد المتبرعين بنفس الألوان كما في الشكل 5.

يرتبط الانخفاض في تعبير مستقبلات الكيموكين مع عدد العدلات في PBMCs

تم ربط تلوث العدلات في PBMCs سابقًا بالتغيرات في النمط الظاهري للخلايا التائية المرتبطة بتخزين الدم بالكامل قبل المعالجة [7]. لاختبار ما إذا كان تلوث العدلات مرتبطًا بالحد من تعبير مستقبلات الكيموكين ، تم رسم التغيير في التعبير عن CXCR5 و CCR6 بمرور الوقت ، معبرًا عنه كنسبة مئوية من القيمة في الوقت 0 ، بالنسبة إلى النسبة المئوية للعدلات داخل كل عينة PBMC فردية (الشكل 7). كان هناك ارتباط ذو دلالة إحصائية بين عدد العدلات التي تلوث PBMCs والانخفاض في التعبير عن CXCR5 و CCR6.

تم تحليل البيانات الموضحة في الشكل 6 كدالة للنسبة المئوية للعدلات منخفضة الكثافة داخل PBMCs. (أ,ب) تم التعبير عن MSIs لتعبير CXCR5 و CCR6 بواسطة الخلايا B في PBMCs المحضرة بعد 6 أو 24 ساعة عند تخزين RT كنسبة مئوية من القيم لعينات 0 ساعة ورسمها بيانيًا مقابل النسبة المئوية للعدلات منخفضة الكثافة داخل PBMCs. يتم تحديد المتبرعين بنفس الألوان الموجودة في الشكلين 5 و & # x200B و 6. 6. (ج,د) تحليل الانحدار الخطي للعلاقة بين زيادة العدلات وانخفاض CXCR5 و CCR6.


تقنية

نصائح تقنية

قم بتنزيل شهادة التحليل

شحن المنتج وتخزينه وعمره التخزيني وقابليته للذوبان

مجموعات العلوم البيولوجية
مدة الصلاحية المضمونة من تاريخ استلام مجموعات العلوم البيولوجية مدرجة في ورقة معلومات المنتج. تحتوي بعض المجموعات على تاريخ انتهاء صلاحية مطبوع على ملصق صندوق الأدوات ، وهذا هو تاريخ الصلاحية المضمون المحسوب من يوم شحن المنتج من منشأتنا. غالبًا ما تكون المجموعات فعالة لفترة أطول بكثير من مدة الصلاحية المضمونة. إذا كان لديك مجموعة قديمة في التخزين وترغب في استخدامها ، فإننا نوصي بإجراء تجربة تحكم إيجابية على نطاق صغير للتأكد من أن المجموعة لا تزال تعمل لتطبيقك قبل معالجة عدد كبير من العينات أو العينات الثمينة.

الأجسام المضادة والمقارنات الأخرى
يتم سرد مدة الصلاحية المضمونة من تاريخ استلام الأجسام المضادة والمقترنات في ورقة معلومات المنتج. غالبًا ما تكون الأجسام المضادة والمقترنات الأخرى وظيفية لفترة أطول بكثير من مدة الصلاحية المضمونة. إذا كان لديك متقارن أقدم في التخزين ترغب في استخدامه ، فإننا نوصي بإجراء تجربة تحكم إيجابية على نطاق صغير للتأكد من أن المنتج لا يزال يعمل لتطبيقك قبل معالجة عدد كبير من العينات أو العينات الثمينة.

بالنسبة للأجسام المضادة المجففة بالتجميد ، نوصي بإعادة تكوين الجسم المضاد باستخدام الجلسرين والمواد الحافظة المضادة للميكروبات مثل أزيد الصوديوم لأطول فترة صلاحية (لاحظ أن أزيد الصوديوم غير متوافق مع اقتران HRP).

المواد الكيميائية والأصباغ والبقع الجل
يضمن Biotium استقرار المواد الكيميائية والأصباغ وبقع الجل لمدة عام على الأقل من تاريخ استلام المنتج. ومع ذلك ، فإن غالبية هذه المنتجات مستقرة للغاية لسنوات عديدة ، طالما يتم تخزينها على النحو الموصى به. يمكن العثور على شروط التخزين في ورقة معلومات المنتج أو ورقة بيانات وسلامة المنتج ، ورقة بيانات سلامة المواد ، وعلى ملصق المنتج. يجب حماية المركبات الفلورية من الضوء للتخزين طويل الأمد.

إذا كان لديك مركب Biotium تم تخزينه لمدة تزيد عن عام واحد وترغب في استخدامه ، نوصي بإجراء تجربة تحكم إيجابية على نطاق صغير للتأكد من أن المركب لا يزال يعمل للتطبيق الخاص بك قبل معالجة عدد كبير من العينات أو الثمينة عينات.

تاريخ انتهاء الصلاحية على أساس تاريخ الصنع (DOM)
إذا طلبت منك مؤسستك توثيق تاريخ انتهاء الصلاحية بناءً على تاريخ تصنيع الكواشف ، فيرجى الاتصال على [email protected]um.com للحصول على المساعدة.

المنتجات الكيماوية ذات اعتبارات الاستقرار الخاصة:

تشمل مركبات استر ما يلي:
• استرات Succinimidyl (SE ، والمعروفة أيضًا باسم إسترات NHS) ، مثل الأصباغ التفاعلية الأمينية
• إسترات أسيتوكسي ميثيل (AM esters) مثل أصباغ مؤشر الأيونات المنفصلة بالغشاء
• الأصباغ المعدلة من الأسيتات ، مثل ViaFluor ™ 405 و CFDA و CFDA-SE وأصباغ تكاثر الخلايا

أصباغ الإستر ثابتة في شكلها الصلب طالما أنها محمية من الضوء والرطوبة. الاسترات ليست مستقرة في محلول مائي. يجب تحضير محاليل المخزون المركزة في DMSO اللامائي (انظر كتالوج Biotium رقم 90082). يمكن تخزين المحاليل المخزنة في DMSO اللامائية مجففة عند -20 درجة مئوية لمدة شهر واحد أو أكثر. يجب تخفيف الإسترات في محلول مائي مباشرة قبل الإستعمال. يجب إذابة استرات Succinimidyl (SE) في محلول خالٍ من المركبات المحتوية على أمين مثل Tris أو glycine أو البروتين ، والتي ستتفاعل مع المجموعة الوظيفية SE. يجب إذابة استرات AM ومركبات الأسيتات في محلول خالٍ من المصل ، لأن المصل يمكن أن يحتوي على إسترات من شأنها أن تحلل المركب بالماء.

ملاحظة على ثبات استر سكسينيميديل صبغة CF ™
استرات Succinimidyl معرضة بشكل عام للتحلل المائي ، مما قد يؤدي إلى انخفاض كفاءة وضع العلامات. الأصباغ كثيفة المسلفنة ، مثل أصباغ Alexa Fluor® ، أصباغ DyLight® و IRDyes® هي أصباغ استرطابية بشكل خاص ، مما يؤدي إلى تفاقم مشكلة التحلل المائي. على سبيل المثال ، يمكن أن تكون النسبة المئوية لـ Alexa Fluor® 488 succinimidyl ester (SE) أقل بكثير من 50٪ بحلول وقت التطبيق (وفقًا لورقة بيانات المنتج الخاصة بالشركة المصنعة). في عدد من أصباغ Alexa Fluor® SE التفاعلية ، يتم اشتقاق مجموعة SE من حمض الكربوكسيل العطري ، بينما في جميع أصباغ Biotium's CF ™ ، يتم تحضير مجموعة SE من حمض الكربوكسيل الأليفاتي. يقلل هذا الاختلاف الهيكلي من قابلية المجموعات التفاعلية SE لصبغة CF ™ للتحلل المائي ، مما ينتج عنه أصباغ تفاعلية مستقرة نسبيًا مع كفاءة وضع علامات أعلى باستمرار مقارنة بمشتقات SE الأخرى لأصباغ الفلورسنت الأخرى.

أصباغ مالييميدات ، MTS وثيوسلفات
مثل صبغات استر succinimidyl ، فإن هذه الأصباغ أيضًا عرضة للتحلل المائي ، على الرغم من أنها بدرجة أقل بشكل عام. وبالتالي ، للتخزين طويل الأجل ، يوصى باستخدام DMSO اللامائي لصنع حلول المخزون.

الأصباغ التفاعلية الأخرى
تكون الأمينات ، والأمينوكسي (المعروف أيضًا باسم أوكسي أمين) ، والهيدرازيد ، والأزيد ، والألكين ، و BCN ، والأصباغ التفاعلية التيراميد ، وكذلك الأحماض الخالية من الصبغة ، ثابتة بشكل عام في محلول مائي عند تخزينها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 6-12 شهرًا أو أكثر , as long as no compounds are present that may react with the dye's functional group. See the product information sheets for specific reactive dyes more information.

Coelenterazines and D-luciferin

Coelenterazines are stable in solid form when stored as recommended they are not stable in aqueous solution. Concentrated coelenterazine stock solutions (typically 1-100 mg/mL) should be prepared in ethanol or methanol do not use DMSO or DMF to dissolve coelenterazines, because these solvents will oxidize the compounds. Ethanol or methanol stocks of coelenterazine can be stored at -20°C or below for six months or longer alcohol stocks may evaporate during storage, so use tightly sealing screw cap vials and wrap the vials with Parafilm for long term storage. Propylene glycol also can be used as a solvent to minimize evaporation. If the solvent evaporates, the coelenterazine will still be present in the vial, so note the volume in the vial prior to storage so that you can adjust the solvent volume to correct for evaporation if needed. Prepare working solutions in aqueous buffers immediately before use. Coelenterazines are stable for up to five hours in aqueous solution.

Aquaphile™ coelenterazines are water soluble formulations of coelenterazines. They are stable in solid form when stored as recommended. Aquaphile™ coelenterazines should be dissolved in aqueous solution immediately before use. They are stable for up to five hours in aqueous solution.

Note that coelenterazines are predominantly yellow solids, but may contain dark red or brown flecks. This does not affect product stability or performance. If your coelenterazine is uniformly brown, then it is oxidized and needs to be replaced.

D-luciferin is stable in solid form and as a concentrated stock solution when stored as recommended it is not stable at dilute working concentrations in aqueous solution. Prepare concentrated D-luciferin stock solutions (typically 1-100 mg/mL) in water, and store in aliquots at -20°C or below for six months or longer. Prepare working solutions immediately before use.

Most of our products are stable at room temperature for many days, but we recommend storage at 4°C or -20°C to prolong shelf life. In the case of many of our aqueous dye solutions, the compounds are very stable at room temperature, but we recommend cold storage to prevent the growth of mold or other microbes over time. Therefore, to save on shipping costs, products with recommended storage at 4°C or -20°C may ship at ambient temperature or with an ice pack. These products may thaw without affecting product performance. When you receive the product, place it under the recommended storage conditions.

Most of our products are stable at room temperature for many days, so in all likelihood the product will still work just fine. To be on the safe side, we recommend performing a small scale positive control experiment to confirm that the product still works for your application before processing a large number of samples or precious samples.

One exception that we are aware of is GelGreen™, which is more sensitive to light exposure than most of our other fluorescent dyes. If GelGreen™ is exposed to ambient light for a prolonged period of time (days to weeks), its color will change from dark orange to brick red. If this occurs, the GelGreen will no longer work for gel staining.


مقدمة

Phytoplankton are responsible for about 50% of Earth’s primary production [1], with diatoms accounting for about half of this [2,3]. As primary producers, phytoplankton form the basis of most marine food webs. In addition, diatoms and phytoplankton in general can serve as indicators of ecosystem change since they are particularly sensitive to shifts in environmental conditions. This is also important in the context of regional and global change, since human activities and associated increases in greenhouse gas emissions have led to simultaneous changes in a number of aquatic abiotic parameters. Consequently, phytoplankton are exposed to the simultaneous effects of multiple anthropogenic stressors, such as increasing temperature and pCO2, as well as shifts in dissolved nutrient concentrations and stoichiometry.

Phytoplankton can respond to changes in environmental conditions at different levels. At the first level, the phenotypic plasticity of individual phytoplankton cells largely determines whether the cells can subsist under changing abiotic conditions. How well a single strain copes with changing environmental conditions depends on the tolerance range of individual cells [4,5]. At the second level, the plasticity of different strains within a population is the critical factor. High plasticity of individual strains has the potential to buffer negative effects of environmental change, while low plasticity of these strains can lead to shifts in population structure [6]. At this level, the sum of the tolerance ranges of different strains within a population determines whether the population can cope with environmental change. The third level of phytoplankton response results in a change in community composition when altered abiotic conditions lead to species selection. Despite the importance of all three levels of response (within strains, between strains, between species), many studies have focused on the response of community [7–9], populations [10,11], and strains [6,12,13], while much less attention has been paid to the phenotypic plasticity of individual cells within a strain.

One of the most important characteristics or traits of individual phytoplankton cells that determine their ecological success is cell size [reviewed by 7], as it is directly correlated with many other traits and is influenced by a range of environmental factors. Smaller cells have lower sinking rates [14], better nutrient uptake due to a higher surface-to-volume ratio, and a smaller diffusive boundary layer [15,16]. On the other hand, smaller cells are often more susceptible to grazing [17]. Thus, cellular characteristics not only affect the ecological role of plankton but are also shaped in part by environmental conditions. Changing temperature and pCO2 regimes could, therefore, have an impact on cellular traits, with consequences for trophic and system processes. So far, most studies of phytoplankton traits and their response to environmental drivers have been conducted using bulk measurements. For example, Hillebrand et al. [18] observed that phytoplankton exhibit large variability in cellular nutrient content at low growth rates and that cellular nitrogen to phosphorus (N:P) ratios converge with increasing growth rate. Hence, faster growth causes cultures to become more similar and their variability to decrease. This phenomenon was first observed by Goldman in 1986 [19]. However, the study by Hillebrand et al. compared different populations and different species, and although the authors conclude that this should be the case, it remains unclear whether the above-mentioned patterns also apply within individual strains. Given the importance of phenotypic plasticity in coping with altered environmental conditions, a proper evaluation of the response of phytoplankton to global change cannot be made without studying their phenotypic plasticity and cell-to-cell variability within individual strains. Flow cytometry, which measures traits of individual cells, is a well-established method to investigate the variability of cellular characteristics such as cell size, pigments, and biochemical components [20–22].

Since current CO2 concentrations are not saturating for Rubisco, the enzyme that catalyzes primary fixation of inorganic carbon [23], higher pCO2 resulting from anthropogenic emissions can potentially favor photosynthesis and phytoplankton growth [24–26]. Furthermore, rising water temperatures caused by increased atmospheric CO2 can affect physiological processes, including growth, resource acquisition, and photosynthesis [27,28]. Additionally, human activities influence the concentrations and ratios of dissolved nutrients such as nitrogen (N) and phosphorus (P), which are essential for phytoplankton growth. Legal restrictions on nutrient inputs to the environment have resulted in increasing N:P ratios, which are predicted to rise even further in the future, as atmospheric N deposition is likely to continue to increase [29], and P reserves on Earth could be depleted in 50 to 200 years if current levels of use are maintained or increased [30,31]. However, as environmental conditions change, the elemental stoichiometry of phytoplankton species and their biochemical requirements will also be affected [25]. Given the influence of these global change drivers on phytoplankton growth rate and the strong correlation of growth rate with other traits such as cell size [25], it is crucial to investigate the phenotypic plasticity of multiple phytoplankton traits, and how the traits are correlated.

Considering that changes in pCO2, temperature, and nutrient concentrations do not happen separately, but rather simultaneously, we conducted a multi-driver experiment with realistic future conditions based on predictions from the Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC). We tested the RCP 6.0 and 8.5 scenarios by simulating a temperature increase of 1.5 and 3°C combined with increasing pCO2 up to 800 and 1000 ppm, respectively, and we combined these scenarios with an increase in dissolved N:P ratios from 16 to 25. Using a single-cell approach, we analyzed the response of a single strain of the diatom species Thalassiosira Weissflogii, currently also named Conticribra weissflogii. Since we acquired the strain we worked with from an algal culture bank under the name تي. weissflogii, we will retain the generic name Thalassiosira in this paper. تي. weissflogii is mostly found in temperate brackish waters, but it has also been isolated all around the globe in areas ranging from the Long Island Sound, New York, USA, to Jakarta Harbor, Indonesia, to the German Bight (North Sea), as well as in the middle of the Pacific Ocean [32–34] and can, therefore, be considered as a cosmopolitan species. بالإضافة إلى، تي. weissflogii is known to react in a number of ways to altered abiotic conditions [35,36]. Sugie and Yoshima [37] reported a decrease in cell size of تي. weissflogii under increased pCO2 and Wu et al. [38] identified a slight increase of growth rate at higher pCO2. Nevertheless, the single-cell plasticity of multiple traits of تي. weissflogii has never been investigated. Since measurements on a single-cell level require certain criteria regarding cell size and chain-formation, we used this well-studied diatom species to analyze the link between growth rate, cell size, and biochemical composition of cells growing under different future global change conditions. More specifically, we tested the hypothesis that not only between species and populations [18] but also within one single strain, cell-to-cell variability of phytoplankton decreases with increasing growth rate. Using flow cytometry, we are able to analyze both, the reaction of single strain populations to different environmental conditions by studying the variation between cultures, as well as the variability within one replicate at a distinct growth rate. The former, we describe in the following as among-strain population variability and the latter as cell-to-cell variability within a single strain population. Both concepts can be used to assess phenotypic plasticity which plays an important role when addressing the question of the effect of global change on phytoplankton.


النتائج

Calibration of Lactadherin/Annexin V Assay

We hypothesized that the PS-binding properties of lactadherin would enable detection of early PS exposure on dying cells. Preliminary binding studies that related PS content to binding of lactadherin and annexin V were performed with synthetic membranes supported by 2-μm glass microspheres ( 26 ) (Fig. 1). The Ca ++ concentration was 1.5 mM near the upper limit of ionized Ca ++ in blood plasma ( 28 ). Because the rate of PE exposure during early apoptosis has not been measured, we evaluated binding to synthetic membranes with minimal and maximal PE content. First, we assumed that PE would not be exposed together with PS. The PS content was varied from 0 to 12% in synthetic membranes with 2% PE (Fig. 1A). The quantity of lactadherin bound increased with PS content and approached a plateau at 8% PS. In contrast, annexin V binding was not detected until the PS content was 8%, after which it increased rapidly. Second, we assumed that the rate of PE efflux would exceed the rate of PS efflux. Synthetic membranes were synthesized with a PE:PS ratio of 4:1 (Fig. 1B). Again, lactadherin binding was proportional to PS content whereas the relationship between PS and annexin V binding was sigmoidal. The presence of excess PE reduced the PS threshold for annexin V to ∼2.5% PS (Fig. 1B). These results indicate that lactadherin can be expected to bind to cell membranes with PS content ≥0.5%, while annexin V is predicted to bind when the PS content exceeds 2.5%–8%, depending on the PE content. Thus, cell membranes that stain with lactadherin, but not annexin V are likely to have membrane PS content <8% and possibly <2.5%.

Similar results were obtained with annexin V conjugated to three different fluorophores, supplied by three vendors. In addition, a conjugate of annexin V-Alexa Fluor 647 prepared in our laboratory yielded the same pattern of binding. The Alexa Fluor 647 conjugate was utilized for the experiments displayed in Figures 1C and 2–5.

Competition binding experiments were performed to determine whether lactadherin and annexin V could compete with each other for the same binding sites (Figs. 1C and 1D). Unlabeled annexin V competed for only about 40% of the lactadherin binding sites on membranes with 4% PS and 15% PE. By comparison, unlabeled lactadherin competed for ∼70% of annexin V binding sites on these membranes. The results suggest that the binding sites for lactadherin and annexin V overlap but are not identical. They indicate, further, that the presence of either protein at concentrations less than 8 nM would not diminish binding of the other by more than 20%. The arrows indicate the degree of displacement predicted for each protein for experiments depicted in Figures 3–5.

Temporal course of lactadherin binding. Flow cytometry analysis indicated that control HL-60 cells exhibited little staining with lactadherin or PI (upper panel-open arrow). After 24 h of treatment with etoposide, three intensities of lactadherin staining were evident (black arrow, open arrowhead, black arrowhead). After 48 h, more than 95% of cells were positive for both lactadherin and PI. With the displayed quadrant markers, the cells positive for both lactadherin and PI increased from 2.4% for controls to 90.4% at 48 h. Contour lines are drawn at intervals of 15% linear event density. The quantity of lactadherin binding to K-562 cells and HL-60 cells at various time points was compared with overlaid histograms (lower panel). The intensities of staining identified on the contour plot are indicated by the same arrow and arrowhead symbols at the same fluorescence intensities. Most HL-60 cells stained with lactadherin at an intermediate level after 24 h and brightly after 48 h. The mean progression of K-562 cells staining by lactadherin in eight experiments is depicted in the lower right panel. The fluorescence intensity gates (M1–M4) are depicted in the center panel, labeled “K-562”. Results are representative of three experiments (upper panel) five experiments (lower left and center panels).

Lactadherin Binding to Apoptotic Cells

We wished to confirm that lactadherin could detect PS exposure on apoptotic cells. Therefore, K-562 and HL-60 cells were treated with etoposide for 48 h and evaluated with conventional stains as well as lactadherin (Fig. 2).

Staining with hematoxylin and eosin confirmed that some K-562 cells had condensed and fragmented nuclei (Fig. 2A). Positive TUNEL staining confirmed that the DNA was fragmented in these cells (Fig. 2B). Costaining cells with lactadherin and propidium iodide (PI) (Fig. 2C) confirmed that PI permeable cells expose sufficient PS to enable diffuse binding of lactadherin. The diffuse blebs that appear transiently in the course of apoptosis ( 29 ) were identified on a small number of cells (Figs. 2D and 2E). These vesicles stained diffusely with lactadherin. Therefore, K-562 cells expose sufficient PS to bind lactadherin as they undergo programmed cell death.

The engagement of PS-binding motifs in staining by lactadherin and annexin V was evaluated in competition binding experiments (Figs. 2F and 2G). Phospholipid vesicles containing 8% PS competed with etoposide-treated cells for both lactadherin and annexin V binding. These vesicles competed for more than 95% of lactadherin binding but only about 85% of annexin V binding. This difference was rationalized by assuming that a larger fraction of annexin V was internalized by the cells ( 16 ). The results confirm that the PS-binding motifs of both lactadherin and annexin V participate in binding to the etoposide-treated apoptotic cells. Addition of EDTA at twice the Ca ++ concentration reduced staining by annexin V but did not decrease lactadherin binding as detected by flow cytometry or by microscopy (not shown). These results confirmed the Ca ++ -dependent PS binding of annexin V and the Ca ++ -independent PS binding of lactadherin. Furthermore, they exclude the possibility that lactadherin binding was mediated by interaction with the αالخامسβ3 or αالخامسβ5 integrins of the dying cells.

Experiments were conducted to determine whether lactadherin could detect PS exposure before cells exhibit increased permeability to PI (Fig. 3, upper panel). Twenty-four hours after initiation of etoposide exposure, three cell populations were evident, indicating the progressive pathway of PS exposure and PI permeability. Approximately 25% of cells remained in the left lower quadrant (solid arrow), but PS exposure was greater than that of untreated cells (open arrow). Approximately 25% were positive for lactadherin staining but negative for PI (open arrowhead). Another 25% exposed the same quantity of PS but were also stained with PI (upper open arrowhead). Finally, a population of cells stained positively for PI and stained very strongly for lactadherin (solid arrowhead). After 48 h the majority of cells stained maximally with both PI and lactadherin. Samples studied at intermediate time points confirmed that most cells progressed through the two intermediate stages identified after 24 h (not shown). These findings indicate that PS exposure begins prior to PI permeability, but that complete PS exposure is delayed for many hours after PI permeability.

Lactadherin staining of both K-562 and HL-60 cells were monitored over 72 h to determine the comparative rates of PS exposure (Fig. 3, lower panel). The results were consistent with progressive PS exposure after treatment with etoposide for both cell types. The arrows and arrowheads on the HL-60 histogram depict the modal fluorescence intensities for untreated cells as well as minimally, intermediate, and maximally responding populations (Fig. 3, 24 h). The elapsed time between etoposide exposure and PS exposure differed for HL-60 cells vs. K-562 cells. HL-60 cells stained within 6 h of etoposide (not shown) while K-562 cells did not stain until at least 12 h had elapsed since etoposide exposure was initiated. Lactadherin staining was maximal for HL-60 cells by 48 h but required at least 72 h treatment for K-562 cells. The mean progression of PS exposure for eight separate experiments is depicted in the lower right panel. The gates utilized to detect the fraction of cells with each quantity of PS exposure are in the K-562 panel. These findings indicate that PS exposure is progressive over more than 24 h for both K-562 and HL-60 cells.

Costaining with Lactadherin and Annexin V

We utilized flow cytometry to evaluate simultaneous staining by lactadherin and annexin V (Fig. 4, upper panel). Dot plots indicate that most cells proceed through a pathway in which staining by lactadherin is increased to a greater degree than by annexin V. For example, prior to etoposide exposure, only 0.6% of K562 cells stained with lactadherin. After 24 h exposure to etoposide, the fraction of the population in the “lactadherin positive” region increased to 32.6%. After 72 h of etoposide exposure, 84.1% were strongly positive for both annexin V and lactadherin. Comparative staining with lactadherin and PI vs. Annexin V and PI confirmed that the two proteins have distinct staining patterns prior to PI staining (not shown). Lactadherin stained the majority of cells with a continuous intensity from negative to highly positive. In contrast, staining with annexin V showed most cells with either minimal staining or bright staining immediately prior to permeability to PI. Very few cells demonstrated intermediate levels of annexin V staining, indicating that most cells had not exposed sufficient PS to reach the annexin V threshold (Fig. 1). Confocal microscopy revealed the cellular features that display PS exposure after 24 h of etoposide exposure (Fig. 4, lower panels). Many cells had minimally changed gross architecture (black arrow) while a similar number were condensed (arrowhead). The normal-sized cells had patches and small appendages that stained with lactadherin (white arrows), but stained weakly or not at all with annexin V. The condensed cells had diffused lactadherin staining, detected as rings, but annexin V staining was punctate. Most cells exhibited staining of internal cell bodies by annexin V. In fact, the internalized bodies were the primary location of annexin V staining rather than the cell surface. These results indicate that an early response to etoposide treatment is localized PS exposure and that the quantity of PS exposure generally remains below the annexin V threshold.

PS exposure time course and topography detected by costaining with lactadherin and annexin V. PS exposure on K-562 and HL-60 cells was evaluated by costaining with lactadherin and annexin V after 24, 48, and 72 h of etoposide exposure. Flow cytometry dot plots indicated that most cells stain dimly with lactadherin after 24 h and stain less intensely for annexin V. After 72 h nearly all cells stained intensely with both lactadherin and annexin V. The fraction of cells in the quadrants indicating positive staining for both lactadherin and annexin V increased from 0.2% to 84%. Confocal microscopy of cells was performed after cells were treated for 24 h. Phase contrast illustrates cells of normal appearance (arrow) as well as smaller, spherical cells (arrowhead). Annexin V stained internal bodies of spherical cells as well as some discrete membrane features. Lactadherin bound diffusely to the plasma membranes of some shrunken, spherical cells and stained focal and protruding membrane features arrows of normal-size and some shrunken cells. A fluorescence overlay illustrates features where staining by lactadherin and annexin V are coincident (yellow) and features stained preferentially by annexin V (red) and lactadherin (green). In some experiments the Ca ++ concentration was increased to 3 mM. Results are displayed as an overlay of red and green fluorescence in addition to phase contrast (yielding a blue background). Annexin V was found primarily on internal bodies while lactadherin was localized to the plasma membrane. An enlargement of a cell undergoing vesiculation is presented to better illustrate the pattern of lactadherin vs. annexin V localization on these cells. K-562 cells are depicted in upper seven panels, and HL-60 cells in lower two panels. Results representative of at least five experiments.

Annexin V and lactadherin staining studies were also performed with Ca ++ increased from 1.5 to 3 mM (Fig. 4), similar to the conditions generally employed to probe apoptotic cells for PS exposure with annexin V. The results showed an equivalent pattern of staining with lactadherin and annexin V. The blue background reflects superimposition of the phase contrast with fluorescence images. An enlarged view of a vesiculating cell, with 3 mM Ca ++ , highlights the preferential binding of lactadherin to membrane vesicles and the preferential localization of annexin V to internal bodies. Experiments were performed with increasing annexin V concentrations, as other investigators have sometimes utilized concentrations much higher than the apparent dissociation constant of <5 nM ( 30 ). These conditions led to increased staining of both etoposide and control cells to approximately the same degree. The results suggest that use of annexin V for selective staining of exposed PS is probably most effectively performed with annexin V concentrations <6 nM.

After 48 h of exposure to etoposide, the majority of K-562 cells exposed sufficient PS to stain with both lactadherin and annexin V (Fig. 5). Some cells had fragmented nuclei and irregular contours, changes that are consistent with completed apoptosis (Fig. 5A, arrowhead). Most cells were round with condensed, but regular nuclei, consistent with the ongoing cell death program (Fig. 5A, arrows). Most of the condensed cells stained diffusely with lactadherin (Fig. 5C, white arrows). Other cells, with a lesser degree of condensation, had scattered membrane appendages that stained with lactadherin, similar to dominant cell morphology observed at 24 h. Annexin V stained internal bodies of the cells with intact nuclei (Fig. 5B) confirming that significant annexin V is internalized over the 10 min time course of these experiments ( 16 ). Annexin V also stained discrete patches on the plasma membranes of these cells. A composite image (Fig. 5D) contrasts cell features that stain preferentially with lactadherin (green) annexin V (red) and highlights regions that stained with both lactadherin and annexin V (yellow).

Progressive PS exposure of K-562 cells costained with lactadherin and annexin V after 48 h etoposide exposure. Phase contrast microscopy (أ) showed cells of normal size and contour (white arrowhead), shrunken, spherical cells (small arrows) and irregular cells with fragmented nuclei (black arrowhead). Annexin V (ب) was identified in intracellular bodies (arrowhead) and in discrete surface patches in a large-portion of the cells. Lactadherin (ج) stained discrete surface patches and protuberances, diffusely stained the membranes of the shrunken, spherical cells (arrows) and brightly stained most of the irregular cell. An overlay image (د) identifies cell features that co-stain with lactadherin and annexin V yellow as well as areas that stain preferentially with each protein. A higher magnification overlay of different cells (ه) shows better the demarcation between internal bodies that stain for annexin V and lactadherin-binding plasma membrane. Contour profiles of lactadherin staining intensity (F) and annexin V staining intensity (جي) illustrate the cell features that stain with lactadherin as well as the relative intensity of staining of different cells. Results are representative of at least five experiments.

The contrasting pattern of staining with lactadherin vs. annexin V is highlighted by the profile analysis of costained cells (Figs. 5E–5G). A composite image at higher magnification demonstrates that some internal bodies stain for both lactadherin and annexin V, though predominantly for annexin V. Color intensity profiles of the same cells illustrated that lactadherin diffusely stained the plasma membrane of cells progressing through the cell death program and that the intensity increased with progressive apoptosis (Fig. 5F). Annexin V stained focal regions of the plasma membrane on these cells and internal bodies (Fig. 5G). Thus, these results indicate that dying leukemoid cells expose PS in three stages. PS exposure on most of the cell membrane remains below the annexin V threshold until the final stage of apoptosis.


Freezing and thawing of cells - (Sep/09/2004 )

Though my experience of handling the cells is less than 2years. I would like to suggest you some things. Even though if you leave DMSO in the media after thawing the cells the dmso in low cocentration is not toxic 2 cells more over once you dilute the small volume of cell suspension in 5-10 ml of media, it further dilutes the dmso. It looks to me like the protocol you are following may be causing the cells to die, I think you recognise the fact that centrifuging at high speed can lead to cell necrosis. One method is to lower the speed of centrifuge maybe 900-1000 rpm for 4-5 min should be adiquate.
Alternatively you should also consider the method you are using for preserving the cells. If you freeze the cells directly in liquid nitrogen this can also lead to cold shock induced cell lysis or damage the membrane, one way of preventing this is gradually lowering the temperature such as storing 4 degrees for few hours then transfering to -20 degree for overnight and then storing in -70 degrees for an couple of days then transfering to liquid nitrogen tanks, by following this method u r not only making the cells to adjust to the lower temp you are also ensuring that they donot undergo cold induced necrosis leading to cell membrane damage and lysis.

I hope this information is of use to you.

If you need any further information you can mail me at [email protected]

I dont agree with preethi or anil as one cannot preserve the cells in glycerol for more than 6-8 months.

Why do you want to pellet your cells after thawing. From your procedure you are using DMSO (1:10). DMSO will not give toxicity at low concentration
My suggestion is to add thawed cell suspn to 5-8 ml culture medium and incubate for a day then change medium. Initial pelleting could be avoided.
I never do a pelleting when I thaw cells (from -85 deg C). I never had a problem with low percentage in revial.

I am experiencing similar problems with my LCL b cell line. See topic title:

LCL B cell culture - Death within 24 hours of thawing.

I might try some of the suggestions here.

أهلا
I am facing problems in thawing of cells. The procedure which we follow is- we take stock from liq. N2 then though it in water bath at 37 degree. Then we take medium in falcon (5ml) then add thawed cells dropwise into it. We then centrifuge it at 1500rpm for 5 mins.
but the problem is that after thawing i am unable to get viable cells.
Almost all cells are dead. So what all modification shall i make ? Its really hard to revive cell line from frozen stock?

This is how to freeze and thaw cells:

Always check the cell viability before freezing. They should be highly viable: about 95%. keep your freezing media ( 10% DMSO in FBS) cold. Centrifuge cells for 1000 RMP for 5 minutes. Prepare labeled cryogenic vials. Cell concentration should be about for e.g. collected from a 50 ml flask, about 50 million cells. You can have 10 vials and about 0.5 milion cells per vial. After you centrifuge, get rid of media completely, gently tap the pellet to make it loose. Add 5 mls of cold freezing media resuspend with a pipet and transfer 0.5ml to each vial. Close the cap tight and place cryogenic tubes in special cryogenic container that has alcohol at the bottom and cool down gradually, they usually hold up to 20 vials. Close the top and transfer the container to -70 freezer. Wait 24 hours and no longer than 15 days before transferring them out of the container into the liquid nitrogen boxes.

To thaw the cells, be very quick, take the viall out still with some liquid nitrogen, walk to the water bath. Take the vial, make sure the cap is very tight, sometimes it becomes loose. thaw the vial holding the opening upward so the water from the water bath does not contaminate cells or if there is some detegent in the water it doesn't become in contact with the inside of the vial . When frozen cell media is almost half thawed (about few minutes), take it under the hood and add 0.5 warm media to the cells and immediately transfer to a flask with about 10 to 15ml warm media in it. DMSO will be diluted and you can check the viability.

Good luck and let us know if it had worked.

When I went through top to bottom of this page, it remind me something I could tell in general

As the wise words (Auguste Rodin) say
"Nothing is a waste of time if you use the experience wisely"

We have -85 Deep Freezer for cell storage in our lab. I got normal revival of cells even after an year, when I preserved them in glycerol. Those were cell lines, not primary cells. The case may be different with primary cells. Yet to get experience with it.

I work with cells not more than half year, but I did met with the similar problem with you. And it's strange that I did all the operation right: thaw quickly, no shaking, and no bubbles when adding medium. But still, I can't get the cell alive, just they don't settle down or very very slow. Plus, I never spin my cell, because I always dilute them into T-75 flask at which concentration DMSO will not be toxic. So the only changes I made I guess is to make sure medium really warm, not just warm them up in 37 degree for 15mins, but 30mins to make sure.

Hi, there
I think the cell line is more tough. I do the similar way to freeze and thaw cells as you suggest above. It works fine. But when I come to fresh spleen cells, I have only 10 percent cells viable after freeze and thaw. My question is that if I am not going to culture the cells after I thaw them, instead I want to do FACS staining and cell sorting, should I dilute them in cold media أو warm media after I thaw them in the water bath? I always leave cells in 37 degree water bath for just one min, but they are still crystal. I don't know whether I can leave them in the water bath for a little bit longer. Thank you!

Spleen cells could survive freeze and thawing as well. I would freeze the same number of cells in two separate containers and thaw them in warm or room temperature media to see the difference atfer 24 hours in 37C0 incubator. I usually take the tube out of the liquid nitrogen then warm it up in the water bath for may be one minute and while still is half frozen i add 37degree media to dilute the DMSO. If spleen cells have been treated with amonium chloride for lysing red blood cells they will become very sensitive to freez/thawing procedure.


تفاصيل المنتج

Target Species Human Product Form Purified IgG conjugated to Alexa Fluor® 488 - liquid Product Form Purified IgG conjugated to Alexa Fluor® 647 - liquid Product Form Purified IgG - liquid Product Form Purified IgG conjugated to R. Phycoerythrin (RPE) - lyophilized Reconstitution Reconstitute with 1 ml distilled water Preparation Purified IgG prepared by affinity chromatography on Protein G from tissue culture supernatant Preparation Purified IgG prepared by affinity chromatography on Protein A from tissue culture supernatant Preparation Purified IgG prepared by affinity chromatography on Protein G from tissue culture supernatant Preparation Purified IgG prepared by affinity chromatography on Protein G from tissue culture supernatant. Buffer Solution Phosphate buffered saline Buffer Solution Phosphate buffered saline Buffer Solution Phosphate buffered saline Buffer Solution Phosphate buffered saline Preservative Stabilisers
0.09%Sodium Azide
1%Bovine Serum Albumin
Preservative Stabilisers
0.09%Sodium Azide
1%Bovine Serum Albumin
Preservative Stabilisers
0.09%Sodium Azide
Preservative Stabilisers
0.09%Sodium Azide
1%Bovine Serum Albumin
5%Sucrose
Carrier Free Yes Approx. Protein Concentrations IgG concentration 0.05 mg/ml Approx. Protein Concentrations IgG concentration 0.05 mg/ml Approx. Protein Concentrations IgG concentration 1.0 mg/ml Fusion Partners Spleen cells from immunised BALB/c mice were fused with cells of the P3U1 myeloma cell line.

الأمريكتان

سيتم عرض الموقع باللغة الإنجليزية.

نحن نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لضمان عمل موقعنا بشكل آمن وسليم ، فهي ضرورية لعمل خدماتنا ولا يمكن إيقاف تشغيلها في أنظمتنا. عادةً ما يتم تعيينها فقط استجابةً للإجراءات التي اتخذتها والتي ترقى إلى مستوى طلب الخدمات ، مثل تسجيل الدخول أو استخدام عربة التسوق أو ملء النماذج. يمكنك ضبط متصفحك لحظر ملفات تعريف الارتباط هذه أو تنبيهك بها ، لكن بعض أجزاء خدماتنا لن تعمل بدونها. مثل ملفات تعريف الارتباط الأخرى التي نستخدمها ، قد تكون ملفات تعريف الارتباط الضرورية للغاية إما ملفات تعريف ارتباط الطرف الأول أو ملفات تعريف ارتباط الطرف الثالث.

نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتذكر إعداداتك وتفضيلاتك. على سبيل المثال ، قد نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتذكر تفضيلات اللغة الخاصة بك.
السماح بملفات تعريف الارتباط المفضلة

نحن نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لجمع معلومات حول كيفية تفاعلك مع خدماتنا ولمساعدتنا في قياسها وتحسينها. على سبيل المثال ، قد نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتحديد ما إذا كنت قد تفاعلت مع صفحة معينة.
السماح بملفات تعريف الارتباط الخاصة بالأداء / الإحصائيات

نحن وشركاؤنا الإعلانيون نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتقديم الإعلانات ، ولجعلها أكثر ملاءمة وذات مغزى بالنسبة لك ، ولتتبع كفاءة حملاتنا الإعلانية ، سواء على خدماتنا أو على مواقع الويب الأخرى ووسائل التواصل الاجتماعي.
السماح بملفات تعريف الارتباط التسويقية


شاهد الفيديو: الفرق بين درجه الحراره الجافه والرطبه في الخريطه السايكرومتريه Wet and dry bulb explained (قد 2022).