معلومة

هل يسير بوليميريز الحمض النووي دائمًا في نفس الاتجاه؟

هل يسير بوليميريز الحمض النووي دائمًا في نفس الاتجاه؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

قرأت أن الطفرات من المرجح أن تحدث على "الخيط الذي يتكاثر به بوليميراز الدنا بشكل غير مستمر". هل يقوم بوليميراز الحمض النووي دائمًا بتكرار نفس الخيط بشكل متقطع ، وإذا كان الأمر كذلك ، فكيف / لماذا؟


ملخص:

في البكتيريا أو الكائنات الحية ذات أصل تكرار واحد محدد جيدًا وكروموسوم دائري ، نعم بالنسبة لمنطقة DNA معينة ، يتم تكرار نفس الخيط بشكل متقطع.

الحيوانات ذات الترتيب العالي ، والتي تقوم بتكرار الكروموسومات باستخدام أصول متعددة للتكرار (أوري) ، هذا أقل وضوحا من الطريق أوري لا تزال غير مفهومة تمامًا ولكن يبدو أنها تنطوي على بنية الحمض النووي. هيكل الكروماتين ديناميكي مما يعني أوري من المحتمل أيضًا أن تكون ديناميكية مما يؤدي إلى مناطق محددة من الحمض النووي من غير المحتمل أن يتم تكرارها دائمًا بشكل متقطع من حبلا محدد جيدًا (أي قد لا يبدأ تكرار الحمض النووي دائمًا في نفس المواقع بالضبط).


أولاً ، كما تعلم على الأرجح ، يتم نسخ الحمض النووي دائمًا في اتجاه 5 إلى 3. لماذا أجاب بشكل جيد في هذا المنشور.

تبدأ شوكات النسخ المتماثل للحمض النووي من أصول النسخ المتماثل. يتم التعرف على أصول النسخ المتماثل من خلال مجمعات التعرف على الأصل. الطريقة التي يحدث بها تكرار الحمض النووي هي من خلال وجود مركبين من بوليميريز الحمض النووي يسيران في الاتجاه المعاكس (أي اثنين من شوكتي النسخ المتماثل ثنائي الاتجاه) من الأصل كما هو موضح في المخطط التالي:

هذا يعني أنه نظرًا للأصول الثابتة للتكاثر في كائن حي (مثل البكتيريا التي عادة ما يكون لها فقط أصل واحد فقط من النسخ المتماثل) ونظرًا لتكرار الحمض النووي في اتجاه 5'-3 '، سيتم تكرار نفس الخيوط بشكل متقطع من الأصل ( أي في المخطط ، الجزء السفلي على اليسار والأعلى على اليمين). فيما يلي عرض شامل للنسخ المتماثل على مستوى الكروموسوم في البكتيريا:

الآن للكائنات الأكثر تعقيدًا، أصل التكرار ليس موقعًا واحدًا بل موقعًا متعددًا عبر الكروموسومات (30'000-50'000 أوري في البشر). من أين يبدأ تكرار الحمض النووي بالضبط ، لا يزال هذا غير مفهوم تمامًا. من المحتمل أن يلعب تسلسل الحمض النووي دورًا ولكن لم يتم العثور على تسلسل إجماعي محفوظ للغاية ويعتقد أن أصول النسخ المتماثل مرتبطة ببنية الحمض النووي بدلاً من ذلك. في جوهرها ، فإن بنية الكروماتين هي ما يبدو أنه يملي أين يبدأ تكرار الحمض النووي ، وبما أن بنية الكروماتين ديناميكية داخل الخلية ، فمن المحتمل أن تكون أصول التكرار ديناميكية أيضًا ، مما يجعل تحديد السلاسل المكررة بشكل متقطع أمرًا صعبًا للغاية (Méchali M ، 2010).

أخيرًا ، إذا كنت تتساءل عما يحدث عندما تصطدم شوكتا نسخ متماثل ، فالجواب بسيط ، حيث يتوقف التكرار ويترك مركبا بوليميريز الحمض النووي الحمض النووي.


بوليميريز الحمض النووي أنا

بوليميريز الحمض النووي أنا (أو بول أنا) هو إنزيم يشارك في عملية تكرار الحمض النووي بدائية النواة. اكتشفه آرثر كورنبرج في عام 1956 ، [1] كان أول بوليميريز DNA معروف (وأول نوع معروف من أي نوع من البوليميراز). تم تمييزه في البداية بـ بكتريا قولونية وهو موجود في كل مكان في بدائيات النوى. في بكتريا قولونية والعديد من البكتيريا الأخرى ، يُعرف الجين الذي يشفر Pol I باسم بولا. ال بكتريا قولونية يتكون إنزيم Pol I من 928 من الأحماض الأمينية ، وهو مثال على إنزيم معالج - يمكنه تحفيز خطوات البلمرة المتعددة بالتسلسل دون تحرير القالب أحادي السلسلة. [2] تتمثل الوظيفة الفسيولوجية لـ Pol I بشكل أساسي في دعم إصلاح الحمض النووي التالف ، ولكنها تساهم أيضًا في ربط شظايا Okazaki عن طريق حذف بادئات RNA واستبدال الريبونوكليوتيدات بالحمض النووي.


ما هو DNA Polymerase

بوليميراز الدنا هو الإنزيم الذي يصنع جزيئات DNA جديدة من نيوكليوتيدات الحمض النووي في عملية تسمى تكرار الحمض النووي. يحدث تكرار الحمض النووي في المرحلة S من الطور البيني قبل الانقسام النووي. إنه نوع من التوليف الموجه للقالب للحمض النووي حيث أن النيوكليوتيدات الجديدة هي قاعدة مكملة مقترنة بالنيوكليوتيدات الموجودة في حبلا القالب. يعد تكرار الحمض النووي أيضًا عملية شبه محافظة حيث يتم استخدام كل من خيوط الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل كقوالب لتكرار الحمض النووي في نفس الوقت ولكن في الاتجاه المعاكس. بشكل عام ، يضيف DNA polymerase النيوكليوتيدات في اتجاه 5 "إلى 3". Helicase هو نوع آخر من الإنزيمات المشاركة في تكرار الحمض النووي ، والذي يزيل الحمض النووي المزدوج الشريطة. يتطلب بدء تكرار الحمض النووي وجود مادة أولية. التمهيدي هو خيط قصير (18-22 قاعدة) من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ، والذي يوفر 3 OH نهاية لتكرار الحمض النووي. بدءًا من 3 'OH نهاية التمهيدي ، يضيف بوليميريز DNA النيوكليوتيدات التكميلية للقالب إلى الخيط المتنامي. تظهر عملية تكرار الحمض النووي في شكل 1.

الشكل 1: نسخ الحمض النووي

بدائيات النوى تحتوي على بوليميريز الحمض النووي من الأول إلى الخامس. Pol I و Pol III هما نوعان من بوليميرات الحمض النووي المسؤولة عن 80 ٪ من تكرار الحمض النووي. تحتوي حقيقيات النوى على بوليميرات α و و λ و γ و σ و μ و δ و ε و η و ι و κ و ζ و و Rev1. تستخدم الفيروسات القهقرية مثل فيروسات الحمض النووي الريبي النسخ العكسي لتخليق الحمض النووي من قالب الحمض النووي الريبي.


مقارنة بين نوع مختلف من بوليميريز الحمض النووي من NEB

يحتوي NEB على سلسلة من بوليميراز الحمض النووي التي تناسب تطبيقات المستخدمين المختلفة. هنا ، سنناقش بعضًا منها ، بما في ذلك Q5 ® و Q5 ® U و Phusion ® و Oneطق.

ما هو Q5 ® بوليميراز DNA عالي الدقة؟

تشتهر Q5 ® بوليميراز DNA عالي الدقة بأدائها القوي والدقيق. ويرجع ذلك إلى أنه يتكون من بوليميراز جديد يتم دمجه في مجال ربط الحمض النووي Sso7d المعزز للمعالجة.

حتى الآن ، يتمتع Q5 ® بأعلى دقة تضخيم (

280 مرة أعلى من طق) وبالتالي لديه معدل خطأ منخفض للغاية. نتيجة لذلك ، فهو مثالي للاستنساخ الجزيئي ويمكن استخدامه مع الأمبليكونات الطويلة أو الصعبة.

ما هي مزايا استخدام Q5 ®؟

Q5 ® مناسب لجميع تطبيقات PCR ومجموعة متنوعة من الأهداف. يتضمن ذلك أمبليكونس عاليه إلى عاليه ، وما يصل إلى 10 كيلو بايت من أمبليكون الجينوم البشري (لأمبليكون الجينوم البسيط: 20 كيلو بايت على الأقل).

ما هي تطبيقات استخدام Q5 ®؟

  1. فائقة الدقة PCR
  2. بعيد المدى PCR
  3. الاستنساخ من مادة في المختبر لتعبير البروتين أو تحليل الجينات
  4. تحليل SNP عن طريق الاستنساخ والتسلسل
  5. الطفرات موقع الموجه
  6. مكتبة NGS الإعدادية

ما هو Q5U ® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase؟

إذا كنت تعمل مع قوالب DNA المحتوية على اليوراسيل أو تستخدم dUTP ، يوصى باستخدام Q5U ® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase الجديد. ما الذي يميز Q5U ®؟ Q5U ® لديه القدرة على قراءة وتضخيم النماذج التي تحتوي على قواعد uracil و inosine. وذلك لأن Q5U ® يحتوي على طفرة في جيب ربط اليوراسيل. علاوة على ذلك ، يمكنك منع انتقال التلوث عند دمجه مع علاج DUTP و Uracil DNA Glycosylase (UDG).

ما هي مزايا استخدام Q5U ®؟

  1. تحقيق تضخيم فائق للحمض النووي المحول إلى ثنائي السلفيت أو نزع الأمين منه أو التالف (على سبيل المثال ، FFPE)
  2. منع التلوث المرحل عند الدمج مع علاج DUTP و Uracil DNA Glycosylase (UDG)
  3. توليد كفاءة تجميع أعلى وتحسين الدقة في استنساخ USER®
  4. قم بتمكين إعداد درجة حرارة الغرفة باستخدام صيغة البدء الساخن القائمة على aptamer

ما هو تطبيق Q5U ®؟

  1. استنساخ المستخدم
  2. تضخيم عالي الدقة لركائز الحمض النووي المحولة أو المنزوعة الأمينات من بيسلفيت
  3. منع الحمل

ما هو واحدطق ® DNA Polymerase؟

واحدطق ® DNA Polymerase هو اندماج طق و Deep Vent ® DNA polymerase المناسب لمعظم تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل. واحدطق ® دقة أعلى مرتين من تيعبد القدير. نتيجة لذلك ، لديها معدل خطأ أقل مقارنةً بـ طق.

نصائح: هل تعلم أكثر واحدطق تتضخم التفاعلات بشكل أكثر كفاءة وقوة عند استخدام درجة حرارة تمديد 68 درجة مئوية؟


ما هو تضخيم Phi29؟

  • نشاط البوليميراز متساوي الحرارة
  • إزاحة حبلا قوية
  • 3’-5 'تدقيق نوكلياز خارجي

إن الجمع بين هذه الميزات يجعل Phi29 خيارًا جذابًا للتطبيقات الحساسة حيث قد يكون MDA أكثر ملاءمة من PCR.

يُظهر Phi29 دقة أعلى بمقدار 100 ضعف مقارنة بالمعيار طق البوليميراز ، بفضل قدرته على التدقيق اللغوي ، مما يضعه في مستوى مماثل للإنزيمات الأخرى عالية الدقة.

ومع ذلك ، المفتاح هو التضخيم متساوي الحرارة. يزيل الإزاحة القوية للخيط الحاجة إلى تدوير درجة الحرارة والتحسين ، مما ينتج عنه عملية أبسط من PCR: درجة حرارة واحدة ، و "دورة" واحدة ، ولا يلزم تحسين.

تتيح هذه الآلية النسخ المتماثل المستمر للقالب ، مما يؤدي إلى تضخيم أسي وتطبيقين رئيسيين: تضخيم الدائرة المتدحرجة (RCA) وتضخيم الجينوم بالكامل (WGA).


تكرار الحمض النووي

1. هيليكاز الحمض النووي (إنزيم) يريح الحمض النووي. يسمى التقاطع أ شوكة النسخ المتماثل.
2. بوليميريز الحمض النووي يضيف النيوكليوتيدات التكميلية ويربط السكريات والفوسفات. ينتقل بوليميريز الحمض النووي من 3 إلى 5 نهاية. يسمى الحمض النووي نموذج ساحل.
3. يضيف بوليميراز الحمض النووي مكمل النيوكليوتيدات على الجانب الآخر من السلم. السفر في الاتجاه المعاكس.
4. جانب واحد هو الساحل الرئيسي - إنها تتبع الهليكاز أثناء استرخائها.
5. الجانب الآخر هو حبلا متخلفة - الابتعاد عن الهليكاز (في اتجاه 5 إلى 3).

يسمى النسخ المتماثل شبه محافظ، لأنه يتم حفظ نصف الخصلة الأصلية دائمًا ، أو & quot؛ محفوظة & quot

المشكلة: تصل إلى شوكة النسخ المتماثل ، لكن الهليكاز يتحرك في الاتجاه المعاكس. يتوقف ، ويترابط بوليميراز آخر أسفل السلسلة.

هذه العملية تخلق عدة شظايا تسمى شظايا أوكازاكي، المرتبطين معًا ligase DNA.

6. أثناء التكرار ، هناك العديد من النقاط على طول الحمض النووي التي يتم تصنيعها في نفس الوقت (شوكات النسخ المتعددة). سيستغرق الانتقال من طرف إلى آخر إلى الأبد ، ومن الأفضل فتح عدة نقاط في وقت واحد.

أخطاء النسخ المتماثل - يمكن أن تسبب طفرة وراثية
- يمنع التخمير بالبوليميراز عدم التطابق
- يمكن أن تقوم إنزيمات إصلاح الحمض النووي بإصلاح الحمض النووي التالف أيضًا

/> هذا العمل مرخص بموجب رخصة المشاع الإبداعي Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.


الفرق بين DNA Polymerase و RNA Polymerase

هذان إنزيمان مختلفان مسؤولان عن وظائف مختلفة تحدث في المستوى الخلوي. في المقام الأول ، يتم تنظيم تكوين خيوط DNA و RNA بواسطة هذه الإنزيمات. تهدف هذه المقالة إلى مناقشة الاختلافات الرئيسية بين هذه الإنزيمات المهمة للغاية للعديد من عمليات الحفاظ على الحياة.

بوليميريز الحمض النووي

يبدأ إنزيم بوليميريز الحمض النووي وظيفته أثناء تكرار الحمض النووي ، في خطوة ترتيب النيوكليوتيدات ذات الصلة لتكوين روابط هيدروجينية بين القواعد النيتروجينية المقابلة لخيوط الحمض النووي الموجودة والجديدة. يصبح هذا الإنزيم وظيفيًا بعد تفكيك بنية الحلزون المزدوج للحمض النووي أو فك لفها بواسطة إنزيم نوكلياز خارجي يسمى DNA هيليكاز. تبدأ بلمرة ديوكسي ريبونوكليوتيدات دائمًا من الطرف الثالث لشريط الحمض النووي. هناك أنواع عديدة من بوليميرات الحمض النووي ، ويتكون كل نوع من بروتين ، مما يعني أنه يحتوي على سلسلة من القواعد الفريدة لإنزيم معين. يوجد حوالي 900 - 1000 من الأحماض الأمينية في سلاسل بوليميراز الدنا البشري. عادةً ، أثناء عملية النسخ المتماثل ، يكون بوليميريز الحمض النووي قادرًا على نسخ تسلسل القواعد النيتروجينية ، بحيث يمكنه إنتاج المزيد من الخيوط المتطابقة من إنزيم واحد. إن تباين هذا الإنزيم في الأنواع المختلفة ليس واضحًا كثيرًا ، حيث أن الوحدات الفرعية التحفيزية لتركيب الإنزيم هي نفسها تقريبًا في العديد من الأنواع. ومع ذلك ، بناءً على تلك التغييرات الطفيفة ، تم تحديد سبع عائلات من بوليميرات الحمض النووي المسماة A و B و C و D و X و Y و RT. تحتوي كل هذه الأنواع مجتمعة على 15 إنزيمًا مختلفًا بين حقيقيات النوى و 5 بين بدائيات النوى.

بوليميراز الحمض النووي الريبي

بوليميراز RNA هو الإنزيم الرئيسي الذي يحفز إنتاج خيوط RNA. عادة ما تعتمد قوالب تسلسل القاعدة النيتروجينية للحمض النووي على إنتاج الحمض النووي الريبي ، وهذا الإنزيم قادر على القيام بالعديد من الوظائف. أولاً ، يتم فك جزء معين من خيط DNA (عادةً ما يكون جينًا) عن طريق كسر الروابط الهيدروجينية بين القواعد المقابلة للخيوط المتعارضة بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، يتم نسخ التسلسل الأساسي عن طريق استبدال اليوراسيل بالثيمين من 3 "نهاية إلى 5" نهاية حبلا DNA. تسمى نقطة البداية لبلمرة RNA لشريط الحمض النووي المحفز بينما تُعرف النهاية الكاملة باسم المنهي. نظرًا لأن هذا الإنزيم يشكل الخيط باستخدام الريبونوكليوتيدات ، فإن مصطلح RNA polymerase يستخدم للإشارة. يمكن أن ينتج RNA polymerase مجموعة من المنتجات بما في ذلك RNA المرسال ، و RNA الريبوزومي ، و RNA الناقل ، و micro RNA ، و ribozyme أو RNA التحفيزي. نظرًا لأن RNA polymerase قادر على فك خيط DNA ، فإنه لا يتطلب إنزيمًا آخر لتفكيك بنية الحلزون المزدوج. في البكتيريا ، يتكون RNA polymerase من أنواع قليلة يُشار إليها باسم α2 و β و β & # 8217 و ω. تختلف بوليمرات الحمض النووي الريبي البكتيرية هذه قليلاً عن بعضها البعض من الناحية الهيكلية والوظيفية. هناك عوامل مساعدة نسخية مرتبطة ببوليميراز الحمض النووي الريبي في أماكن مختلفة لتعزيز الوظيفة ، خاصة في بعض البكتيريا مثل الإشريكية القولونية.

ما هو الفرق بين DNA Polymerase و RNA Polymerase؟

• يشكل بوليميراز الدنا خيطًا من الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين ، في حين أن بوليميراز الحمض النووي الريبي يشكل خيوط الحمض النووي الريبي من النوى الريبية.

• RNA polymerase قادر على أداء العديد من الوظائف مقارنة بما يمكن أن يقوم به DNA polymerase.

• يشكل بوليميراز الحمض النووي الريبي مجموعة متنوعة من المنتجات ولكن ليس بوليميريز الحمض النووي.

• يبدأ بوليميراز الحمض النووي في العمل من نهاية 3 بوصات من خيط DNA ، بينما يمكن أن يبدأ بوليميراز الحمض النووي الريبي في العمل في أي مكان من خيط الحمض النووي من 3 "نهاية إلى 5" اتجاه نهاية.


تكرار الحمض النووي DNA بوليميريز

قم بتنزيل الفيديو من iTunes U أو Internet Archive.

لذا في المحاضرة الأخيرة قضيت وقتًا طويلاً في محاولة نقل فكرة عن كيفية اكتشاف بنية الحمض النووي. البيانات البلورية التي أدت إلى ذلك ، كما قلت ، تم جمعها بواسطة روزلين فرانكلين. ورأيت أنه كان هناك بعض الالتباس حول هذه الصورة التي عرضتها عليكم بعد ذلك. هذه ليست صورة حلزون مزدوج. هذا ما حدث عندما ارتدت الأشعة السينية من بلورة الحمض النووي. هذا هو نمط الحيود الذي رأته. ومن ثم يعمل المرء عكسيًا من ذلك في محاولة لمعرفة نوع الهيكل الذي كان من شأنه أن يتسبب في نمط الانعراج هذا. وعليك أن تكون عالم بلورات أشعة سينية جيدًا لاستخلاص أي نوع من الاستدلالات من ذلك.

وهناك أناس ، بمن فيهم فرانسيس كريك ، الذين رأوا الآثار المترتبة على ذلك على الفور. لكن النقطة هي أنها جمعت البيانات ومن ثم شخصين أخبرتك عنهما حينها تعرفين جيدًا باسمهما ، وهما جيم واتسون وفرانسيس كريك ، وهما الشخصان اللذان جاءا بالنموذج الذي شرح نمط الانعراج.

وبالتالي تعلمنا بنية الحمض النووي على أنه حلزون مزدوج الشريطة. حاولت أيضًا إثبات أنه لم يكن هناك اثنان من العباقرة جلسوا في الغرفة ، وألقوا نظرة على هذا وظهروا مع العارضة. لقد كانت قصة أناس حقيقيين يعانون من أخطاء وأخطاء ويتعافون من الأخطاء وما إلى ذلك. كانت أيضًا مجموعة صغيرة جدًا. وسأستغرق دقيقة صغيرة جدًا في بداية الفصل لأن لدي زميل ، فيرنون إنجرام الذي يجلس هنا في المقدمة ، والذي كان عضوًا في هذه المجموعة الصغيرة جدًا مع جيم واتسون وفرانسيس كريك. لذلك كان هناك حيث حدث كل هذا. وتقريباً لا أحد في العالم لديه فرصة في جيلك للاستماع مباشرة من شخص كان هناك عندما حدث ذلك. لذلك سأل فيرنون عما إذا كان سيأتي ويتحدث معك قليلاً فقط عما كان عليه أن يكون هناك.

حسنًا ، شكرًا غراهام. يبدو أنك في حالة مثيرة للغاية في 7.014. هذا الهيكل من سر الحياة لا أقل. ومن المثير للاهتمام أنه على الفور عندما وضع واتسون وكريك نموذجًا لجزيء الحمض النووي الذي يناسب بيانات الأشعة السينية ، كانت هذه هي النقطة ، كيف تعرف أن النموذج صحيح؟

نظرًا لوجود مسافات معينة في النموذج ، ويجب أن ترتبط تلك المسافات تمامًا بمسافات بقع الأشعة السينية في نمط الانعراج الذي رأيته. هذه هي الطريقة التي تعرف بها أن النموذج الذي قمت بإنشائه وفقًا لمواصفات معينة يتوافق مع ما يتكون منه جزيء نفسه في البلورة التي تقوم بفحصها بالفعل. لقد كان من قبيل المصادفة أن أعمل كعالم كيمياء حيوية في مركز البحوث الطبية ، ومختبر مجلس البحوث الطبية في مختبر كافنديش حيث كان واتسون وكريك يعملان. حادث محض. كان معملًا مزدحمًا للغاية ، كما قال جراهام. وهذا شيء يجب أن تتذكره. عندما تختار معملًا للعمل فيه ، اذهب دائمًا إلى معمل مكتظ. لا تذهب أبدًا إلى مختبر حيث توجد مساحة كبيرة لأن المختبر الناجح حقًا يجتذب الكثير من زملاء العمل والزائرين بحيث يزداد ازدحامًا سريعًا. وكان هذا هو الحال في هذا المختبر. كان المخرج ماكس بيروتز. قام المدير المشارك جون كيندرو بإجراء تصوير البلورات بالأشعة السينية للبروتينات لأول مرة تقريبًا ، وحل بنية البروتين. كان فرانسيس كريك طالب دراسات عليا في ماكس بيروتز يقوم بعمل الدكتوراه. وأول شيء أتذكره عن فرانسيس كان عندما ذهبت إلى هناك كعالم كيمياء حيوية للعمل مع ماكس بيروتز ، عندما ذهبت إلى هناك ، كان هناك رجل طويل القامة يتنقل باستمرار بين الطابق العلوي من المبنى ، ومكتبه في المنتصف والطابق آلات الأشعة السينية في الأسفل. كان يصعد ويهبط باستمرار. وفي تلك الأيام لم يكن للمباني مصاعد أو مصاعد كما يسميها الإنجليز.

لذلك كان في حالة بدنية ممتازة. مزدحم للغاية ، ومختبر متواضع للغاية. والشيء المنسي عادة هو عضو رئيسي في تلك المجموعة ، مهندس ، توني برود ، شخص رئيسي لأنه اخترع ما كان آنذاك أفضل آلة تصوير بالأشعة السينية وأكثرها كفاءة في العالم ، آلة تصوير بالأشعة السينية ذات القطب الموجب.

ونظرًا لخبراء علم البلورات بالأشعة السينية في تلك المجموعة ، كانت هذه الآلة متاحة ، نظرًا لأنهم كانوا مجموعة هيكل الأشعة السينية البارزة في العالم. كانت وظيفتي كعالمة كيمياء حيوية بروتين الكيمياء الحيوية وضع ذرة ثقيلة ، زئبق ، ذرة ثقيلة جدًا في بلورات الهيموجلوبين الخاصة بـ Max Parutz في أماكن محددة. هذا له تأثير يمكن التنبؤ به على نمط الأشعة السينية وهذا يمكّن من إنشاء مخطط فورييه بقيم طور حقيقية لانحرافات الأشعة السينية ، للفيزيائيين من بينكم هنا. هل يوجد فيزيائيون هنا؟

نعم ، اعتقدت ذلك. كانت تلك خطوة كبيرة إلى الأمام وكانت أيضًا خطوة كبيرة في اكتشاف بنية عينات الحمض النووي شبه البلورية التي أشار إليها البروفيسور ووكر للتو.

كل ذلك يعتمد على المهندس توني برود الذي لم يذكر في أي من هذه التواريخ ، لكن بدونه لم يكن هذا ليحدث. لذلك كان مكانًا مثيرًا للعمل فيه ، مثيرًا للغاية. كنا جميعًا صغارًا في تلك الأيام. وتعيش حياة الشباب والشابات مع كل التعقيدات التي تنشأ عندما تجمع مجموعة كاملة من الشباب النشيطين للغاية ، والشابات النشيطات للغاية معًا. وأعني بذلك العلاقات الشخصية التي يمكن أن تتدخل أحيانًا عندما تكون في موقف مزدحم ونشط للغاية. ودائمًا ما يكون ممتعًا للغاية ، يمكنني أن أخبرك بذلك. يمكنني أن أعطيك الفصل والآية.

لكن الأمر لا يختلف كثيرًا عن الأشخاص في عمرك الآن ، أليس كذلك؟ أعني أنني لا أقول أنه يتعارض معك ، في بعض الأحيان قد يحدث. لكنه كان معملًا مثيرًا ، وقتًا مثيرًا للتواجد هناك لأننا لم نكن المجموعة الوحيدة التي تحاول اكتشاف بنية الحمض النووي. كان لينوس بولينج من معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا منافسًا كبيرًا ، حيث تغلب على نفس المجموعة مرة واحدة ، مؤخرًا ، على حلزون ألفا ، المكون الأساسي لبنية البروتين. حصل على الإجابة الصحيحة أولاً ، انعكاس 1.5 أنجستروم ، حلزون ألفا. ومجموعتنا ، ماكس باروتز ومجموعتنا كانت مخطئة. لذا كانت المجموعة تتألق في ظل هذا النوع من الهزيمة ، إذا أردت.

والمنافسة حافز رائع ، طالما أنك لا تدعها تخرج عن نطاق السيطرة. حسنًا ، لا داعي للقول إننا لم نفعل ذلك ، لكن المنافسة مع مختبر باولينج كانت بالتأكيد شديدة لدرجة أننا انتظرنا الرسالة التالية. كما ترى ، في تلك الأيام ، لم تصل المعلومات العلمية الجديدة عن طريق المنشورات ، وهذا طويل جدًا ، ولكن عن طريق الرسائل الشخصية. وفي الواقع ، جمعت المعاهد الوطنية للصحة كل هذه الرسائل المتنوعة في مجموعة فرانسيس كريك. وعندما يكون لديك وقت يجب أن تنظر إلى هؤلاء. إنها ممتعة للغاية لأنها تخبرك بطريقة لا تخبرك بها الورقة العلمية.

ما أشعر به حيال نتائج تجربتي. ما تشعر به حيال نتائج تجربتها. ماذا يعني ذلك بالنسبة لي كشخص ، بالنسبة لها كشخص ، بالنسبة له كشخص. لذلك كنا نراقب البريد باستمرار ونناقش الأخبار فور ورودها ، في الغالب أثناء تناول الجعة في الحانة المجاورة. كان ذو موقع ملائم للغاية. لكن كونك مجموعة صغيرة مزدحمة معًا جعل التواصل داخل مجموعتنا أمرًا سهلاً للغاية بالفعل.

وكان لدينا معارك. لا أقصد المعارك الجسدية.

خضنا معارك علمية. وبصفتي عالم كيمياء حيوية ، تمكنت من تسوية معركة حاسمة بين مصممي البلورات كريك وواتسون الذين كانوا يبنون النموذج. لأنهم ، بصراحة تامة ، لم يكونوا يعرفون الكثير من الكيمياء. وكانوا يحاولون بناء نموذج بتأكيد خاطئ لرابطة الببتيد. لم يدركوا أن الرابطة الببتيدية لها تأكيدات محتملة.

وقد مروا في وقت ما بوقت عصيب يحاولون فيه ملاءمة كل شيء معًا لأنهم كانوا يستخدمون التأكيد الخاطئ.

أنا أتحدث عن لاكتام لاكتيم لأولئك منكم كيميائيين عضويين وهذا يعني شيئًا ، تأكيدًا. وبمجرد حصولهم على التأكيد الأول ، تم النقر فوق النموذج في مكانه.

لذلك ساعدنا جميعًا ، هذا ما أحاول قوله.

لقد ساعدنا جميعًا بهدف واحد عظيم في الاعتبار. كان واضحا.

وأنت تعلم مما قاله البروفيسور ووكر ، أن بنية الحمض النووي ، في بنيتها تحمل مفتاح السلوك الفسيولوجي الحاسم للحمض النووي. وقد قال كريك وواتسون هذا في بحثهما الأول ، فإن الهيكل نفسه بسبب تكامله يعطيك فكرة فورية عن كيفية تكرارها. وتكرار بنية الحمض النووي من جيل إلى جيل هو بالطبع الشيء الحاسم في الحمض النووي. النسخ ، النسخ الدقيق من جيل إلى جيل. وذلك من خلال هيكل الأشعة السينية. لهذا السبب كانت بنية الأشعة السينية مهمة جدًا ، لأنها أعطتك فهمًا فوريًا لدور الحمض النووي في علم الأحياء الحديث. اذا هذا ما فعلناه.

وفي النهاية ، أصبح الأشخاص في المجموعة مزدحمين جدًا لدرجة أنهم بنوا معملًا ضخمًا كان جميلًا ، مثل أي مختبر جديد.

لكن الشيء الذي أتذكره أكثر من أي شيء هو الجو في ذلك المكان.

لذلك تذكر ، عندما تذهب وتختار معملًا ، اختر مختبرًا مكتظًا.

وسوف تسدد. [تصفيق] شكرا جزيلا لك. كان ذلك رائعًا حقًا.

لا أعرف ما إذا كان البعض منكم قد أدرك مدى ندرة هذا الاكتشاف لبنية الحمض النووي. كما قلت ، ربما يكون أحد الاكتشافات الكبرى للبشرية. لأنه ، كما قال فيرنون ، يمكنك رؤية الكثير من أسرار الحياة بمجرد رؤية هذا الهيكل. قلة قليلة من الناس سمعوا من شخص كان هناك في ذلك الوقت. ربما ستنسى مجموعة من الأشياء في المستقبل ، لكن آمل أن تتذكر أنك سمعت شخصًا كان هناك عندما كان ويسون وكريك هناك وربما نصيحته الإضافية حول اختيار المختبر.

لقول شيء واحد بسرعة ، أعتقد أن البعض منكم فهم ما كنت أحاول القيام به. قضيت وقتًا طويلاً في الحديث عن العلم الذي يقوم به أناس حقيقيون يقومون بتجارب حقيقية.

شكرا لتعليقاتكم. لقد بذل القليل منكم قصارى جهدهم ليقولوا إن هذا كان مضيعة للوقت ولم تفهم لماذا لم أعلمك شيئًا بدلاً من القيام بشيء ما في الاختبار.

حسنًا ، أنا أقوم بإجراء الاختبار. وإذا كنت لا تعتقد أنه سيكون هناك شيء ما في العملية العلمية في الامتحان الثاني فسوف تفاجأ. لذلك أقضي الكثير من الوقت في هذا الأمر ، والسبب هو أنك طالب في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا.

كما تعلم ، يمكنك الذهاب إلى العديد من الأماكن في الدولة لحضور العديد من دورات علم الأحياء بالمدارس الثانوية ويمكنك الحفظ ، سيخبرك شخص ما بحفظ كل ما هو موجود في الكتاب ، وستختبر ما إذا كان بإمكانك حفظه. أنتم يا رفاق في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا لأن لديكم القدرة على أن تكونوا قادة في كل ما تفعلونه.

لقد قمت بالانتقال من كوني طالب جامعي يحاول حفظ الأشياء في كتاب مدرسي إلى العمل على أحدث ما توصلت إليه.

لقد حققت بعض الاكتشافات المهمة بشكل معقول في العلوم ، كما فعل زملائي الآخرون في القسم ، وبعضهم حقق نجاحًا أكبر من أنا. ولكن مع ذلك ، إذا كنت على أحدث طراز ، فأنت تتعامل مع كل الأشياء م أحاول إخباركم في هذا الشيء. أنت تعمل كجزء من مجموعة.

هناك منافسة. هناك علاقات شخصية. أنت ترتكب أخطاء.

أنت تتعافى منهم. أنت تقوم باستدلالات.

أنت تختبر النماذج. هذا تفاعل معقد جدًا ، حقيقي جدًا ، ديناميكي جدًا ، بشري جدًا. أتمنى أن تكون قد حصلت على القليل من نفحة من ذلك من فيرنون. ولن أكون كذلك ، فأنا قادر تمامًا على إعادة إنتاج الرسوم البيانية من الكتاب المدرسي دون محاولة إعطائك فهمًا أعمق ، وهذا ما أحاول القيام به هنا. وآمل إذا لم يكن من المنطقي بالنسبة لك في النهاية أن يحصل عليها على الأقل عدد قليل منكم.

وأولئك الذين أعتقد منكم رأوا ما كنت أفعله أنا أقدر إخباري بذلك في الأشياء. هؤلاء مجهولون لذلك لا أعرف ، لكن اثنين منكم يحاولون بالتأكيد توضيح أنك لا تعتقد أن الأمر يستحق وقتك لإلقاء محاضرة.

أحاول أن أخبرك لماذا أحاول القيام بذلك.

أحاول أن أعلمك بطريقة أعمق. وهذه دورة مطلوبة.

إنه مهم لحياتك. آمل أن يرى البعض منكم ذلك أو إذا لم تره الآن فسترى ذلك لاحقًا في حياتك المهنية.

نعم. الآن ، سوف نتحدث عن تكرار الحمض النووي.

سأبدأ بالقيادة في بعض التفاصيل التي ربما تكون أكثر من نوع الأشياء التي تتوقعها. أريد فقط أن أوضح نقطة واحدة سريعة هنا. لقد تحدثت عن انقسام الخلايا ورأينا هذا ، كيف أن الخلايا تأتي من خلايا أخرى لتنتج المزيد من الخلايا.

لقد عرضت عليكم هذا الفيلم الصغير الذي شاهدتموه عدة مرات لانقسام خلية الخميرة ، لكن كل الخلايا تنقسم.

ها هي الخلية السرطانية المنقسمة. إذا أصبت بالسرطان ، فهذه خلية نسيت كيفية التوقف عن الانقسام وتنمو لتكوين ورم. هناك انقسام الخلية السرطانية. إنها لا تختلف عن الخميرة على المستوى الجزيئي ، فهي متشابهة جدًا جدًا. لكن هناك نقطة أخرى. لقد أخبرتك كيف أن بنية الحمض النووي مع الخيوط التكميلية مع اقتران G مع اقتران C و A مع T أدى على الفور إلى تكوين فكرة عن كيفية تكرار المادة الجينية. وأنتم تعلمون يا رفاق أن الروابط الهيدروجينية بين الأزواج القاعدية مرتبطة ببعضها البعض والتي تساوي واحدًا على عشرين قوة الروابط التساهمية.

لذلك يمكنك تقشير الخيوط دون كسر الروابط التساهمية. وبعد ذلك ، من خلال إقران A مع T و G مع C والقيام بذلك على كلا الجدولين ، يمكنك الحصول على نسختين متطابقتين.

وهكذا إذا قمت بعمل نسختين متطابقتين وفعلت ذلك مرة أخرى ، فستحصل على ثمانية. أحد الأشياء التي أدركناها على مدار العامين أو الثلاثة أعوام الماضية أثناء النظر في الاختبارات ، بطريقة ما ، على الأقل بعض أفراد الفصل ، لم يربطوا العمل بشأن الخلايا القادمة من خلايا أخرى وتكرار الحمض النووي لإعطاء الحمض النووي للابنة. وأنا أحاول فقط توضيح النقطة التي ترتبط بها. في كل مرة تنقسم فيها الخلية يجب أن تكرر معلوماتها الجينية.

لهذا السبب سأخبركم عن تكرار الحمض النووي.

هذه صورة لنفس الخلية السرطانية ، لكن انتبهوا هنا.

هذا هو الحمض النووي. وترى أنها مضاعفة. وانظر كيف تفكك الحمض النووي ، وهو الكروموسومات ، بحيث يكون لديك في النهاية خليتان ولديك نسخ متطابقة من الحمض النووي.

لذا إذا كنت تدرس السرطان ، على سبيل المثال ، فإن هذا النوع من الأشياء مناسب لك. نعم. إذن مسألة كيف - حسنًا ، قبل أن أفعل ذلك ، أنا آسف. فقط بضعة أشياء حول تكرار الحمض النووي قبل أن أغوص في هذا. لذلك بدأنا جميعًا كخلية واحدة. لدي الكثير من الوضوح لأنني مكونة من الكثير من الخلايا. إذا أخذت كل الحمض النووي في جسدي وقمت بتجميع كل الجزيئات فيه ، فهل لديكم أي فكرة عن المدة التي سيستغرقها ذلك؟ من يعتقد أنه سيصل دعنا نقول عبر الغرفة؟ نعم. عبر الحرم الجامعي؟

عبر كامبريدج؟ حول العالم؟ إلى القمر؟ هل غادر أحد؟

للشمس؟ لدي عشرة أس أربعة عشر خلية.

يوجد حوالي متر أو مترين في كل زنزانة. من 10 إلى 20 مليار ميل من الحمض النووي في كل من أجسامنا ، الحمض النووي البشري.

كانوا يذهبون إلى الشمس ذهابًا وإيابًا عدة مرات.

لذلك كان لا بد من تكرار هذا القدر الكبير من الحمض النووي من أجل البويضة المخصبة التي بدأنا جميعًا لتصبح أنت.

شيء آخر ، دقة النسخ حوالي عشرة إلى العاشر ناقص. لا يشعر معظم الناس ، بمن فيهم أنا ، بشعور جيد تجاه الأسس. هذا خطأ واحد في 10 مليارات. كما تعلم ، يمكن أن يكون خطأ واحد من 10 إلى 99. حسنًا ، ما هو خطأ واحد في 10 مليار يعني؟ لذلك دعونا نربطها بشيء نعرفه.

إذا كنت أكتب ، دعنا نقول كلمة مكونة من ثمانية أحرف ، 60 كلمة في الدقيقة ، 24 ساعة في اليوم ، 7 أيام في الأسبوع ، وكنت جيدًا مثل استنساخ الحمض النووي ، فكم مرة سأخطئ؟ حتى يتمكن كل واحد من التفكير في المدة التي تعتقدها. لكن إذا كنت جيدًا في المتوسط ​​، فسأرتكب خطأ مرة واحدة كل 38 عامًا.

لذلك أنا على وشك أن أخبركم عن عملية مدهشة تمامًا من حيث السرعة والمدى الذي يمكنك القيام به وبدقة تتجاوز ما اعتدنا عليه في حياتنا العادية.

فكيف تفعل هذا؟ يجب أن يكون أكثر من مجرد فصل الخيوط. وكان هناك بعض الالتباس حول سبب تأكيدي على 5 أعداد و 3 أعداد.

حسنًا ، كل من هذه الوحدات الفرعية ، كل نوكليوتيد ، هذا عبارة عن 3 هيدروكسيل رئيسي وهذا هو الموضع الخامس. إذا كنا نجمع الوحدات الفرعية التي لديها خطاف وعين ، فسيحدث فرقًا لأنها ليست متماثلة في كلا الطرفين. إذا كنا سنبدأ في الربط معًا ، فهذا هو الشيء نفسه تمامًا عندما نصل إلى المستوى الكيميائي الحيوي ، فإن الطرف 5 الأساسي ليس هو نفسه الهيدروكسيل في الطرف الثالث لأن كل شيء غير متماثل.

لذا فإن الإنزيمات التي تنسخ الحمض النووي تُعرف باسم بوليميرات الحمض النووي.

وكان من الصعب للغاية معرفة كيفية عملهم ، لكن آرثر كورنبرج كان أول شخص يحل هذه المشكلة. لقد كان عالم كيمياء حيوية موهوبًا بشكل غير عادي. لا يزال في ستانفورد. وما وجده هو أنه إذا كان لدينا نهاية مكونة من 5 أعداد أساسية ، فسيكون هذا هو الطرف الثالث ، وهناك 3 هيدروكسيل أولي وهو هذا هنا. وقد تم إقران هذا ، على سبيل المثال ، بحرف C و A مقترنين بحرف T. ودعونا نقول أن G مقترنًا بحرف C هنا. ودعنا نقول أن قاعدة النموذج التالية كانت ، لنجعلها T. ما تمكن آرثر كورنبرج من العثور عليه هو نشاط إنزيم يحفز تكرار الحمض النووي المعتمد على القالب. كان هذا أمرًا بالغ الأهمية لأنه كان عليه أن يجد ، إذا كسرت الخلايا مفتوحة ، في مكان ما في هذا التلويح من الإنزيمات والأشياء من داخل الخلية. يجب أن يكون هناك شيء يمكنه نسخ الحمض النووي. لذلك من أجل القيام بذلك كان عليه أن يعمل على اختبار. وكان عليه أيضًا أن يكون لديه نوع من التخمين بشأن ما ستستخدمه الخلية من أجل تنفيذ التخليق. لكن الشيء الوحيد الذي كان واضحًا نوعًا ما هو قالب الحمض النووي لأنه كان عبارة عن نسخ. لكن الجزء الآخر كان يجب أن يكون لديك طاقة لتشكيل رابطة تساهمية.

لذا بطريقة ما يجب أن يكون هناك شيء ما تم تنشيطه مع الطاقة المضمنة في الجزيء بحيث ينزلق كل شيء في الديناميكا الحرارية إلى أسفل عند تكوين رابطة. وكان يعلم أن الخلية بها ثلاثي الفوسفات ، من نفس النوع الذي تحدثنا عنه عندما تحدثنا عن ATP.

So this would be a deoxyribonucleotide triphosphate.

And he was able to make a guess, because he had to try things until he found something that would work, that this was what's used in DNA synthesis. So this hydroxyl ultimately attacks this phosphate here. And these two other phosphates then come off as a leaving group. So if we thought of it as a pea like this with two more peas here, these two come off and you get a new bond formed to the phosphate. And so what Kornberg then was able to find by using a DNA template that had this sort of structure and [TTATA?] like this, that he was now able to get an A added here. This hydroxyl here became the new hydroxyl.

And so the direction of synthesis, this strand is the other way, so the direction of synthesis of a DNA polymerase, it's polymerizing in the 5 prime to two 3 prime direction. This was again an amazing discovery because it was the first time that anyone had found an enzyme that could copy DNA. Arthur Kornberg got a Nobel Prize for it. But at this point actually genetics came in because there was a scientist John Cairns who was at that point down at Cold Spring Harbor, as I told you the other day. And John, in spite of the fact that Arthur had found a DNA polymerase that had all the properties that you would expect for copying DNA, didn't think that was the one that actually copied the DNA necessary for cellular replication.

So he reasoned if he was right he'd be able to find a mutation that would eliminate the activity of that enzyme and the cell would still live.

And so they did a screening, and it was a lot of work, but they eventually found a mutant of E. coli that lacked this DNA polymerase that Arthur Kornberg had discovered. And the cell was still alive and was still replicating its DNA. So it told both John and then Arthur there must be another enzyme in the cell.

And so Arthur went back. And now working in a mutant that was missing this first polymerase he discovered he found the one that really replicates the DNA. The first one is important, too. It's needed for DNA repair. I'm going to talk to you about that in next lecture, but it's not absolutely crucial for life. And there's an interplay of genetics and biochemistry.

And you'll see I'm just sort of foreshadowing what we're going to get to when we talk about the genetics of this.

And I know a couple of you clearly were frustrated about me showing you pictures of the people who did this, but nevertheless since this was such a historic event a couple of years ago at Cold Spring Harbor.

This you see the helix model down there. There was Jim Watson opening the symposium. When I got up to talk I said, well, I told my students that I'd let them know what it was like when I was there, so I took out a camera and I took a picture of the audience.

And so there are a bunch of Nobel Laureates and types here who were sitting there smiling for you guys in the class. And there was Arthur Kornberg giving his talk. Now, these DNA polymerases are incredible protein machines. The crystal structures of DNA polymerases operating their template have been solved.

And you can solve, depending on how many diffractions you can get, you can get a model that's more and more detailed.

And there have been very high resolution models of DNA polymerases.

This blue and white stuff is the surface of the protein, and this is sort of a template and the various parts.

Just to give you an idea here are these tracings of the shapes of the electron density. You can see how the crystallographers have fit the nucleotides right in the crystal into these electron densities. And here putting it together a bit in the blue is the secondary structure of the protein and the templates and whatnot. And I don't expect you to see very much in that, but the point is I wanted to sort of just set you up to show you this little movie. Because DNA polymerases are incredible machines. They copy at about a thousand nucleotides a second and their accuracy is really amazing.

And I'll tell you all the tricks to the accuracy in the next lecture, but I want to show you this little movie because this is sort of a simulation of what must happen every time a nucleotide is added.

Now, we'll see this over and over again so I'll take it in pieces.

The yellow and the orange are the secondary structures.

That's an alpha helix. And certainly one thing you can see is happening, as we're looking at this, is the parts of the protein are moving during this. So you can see this alpha helix that's sort of swinging up and swinging back down.

Now, what's over here is the template base.

That's the base that correspondents to the T that I was just showing you here. This is the incoming nucleotide.

There is the triphosphate coming down here. And, in fact, you just see those two phosphates going.

So what's happening here, this is going to be the end of the growing chain. It's going attack right there, join the phosphate and the pyrophosphate will leave.

And if you'll take a look, when you see this movement of this helix from the beginning state to up to here, you'll see what happens.

It's squeezing the template base and the incoming nucleotide together.

What it's really doing is testing for the correct shape.

Remember the shape of an A-T base pair and a G-C base pair is the same.

And if those of you who are confused about guanine and the keto-enol thing, try to draw hydrogen bonds with the enol form of guanine and see how you do. I think you'll begin to understand a bit. So at the heart of life is something that can copy DNA. And there are these exquisitely beautiful machines. The replica machine in E.

coli has 18 proteins and the ones in our bodies are even more sophisticated with even more parts. نعم. But to replicate a DNA molecule there's another problem that comes up.

Because DNA polymerases copy -- -- and grow chains in a 5 prime to 3 prime direction.

And they need a 3 prime hydroxy terminus. So they won't work if you just gave it a single strand of DNA.

No DNA polymerase can handle that. It has to have something like this where there's a template strand -- -- and there's what's known as the primer strand.

So there has to be something that has the 3 prime hydroxyl and there has to be something that's going to provide the template that's going to be copied. So if we pull strands apart like this with 5 prime to 3 prime then they'll be 5 prime to 3 prime running in the opposite direction. If we have a template like this, this is OK because the strand here can be copied 5 prime to 3 prime.

This is the new strand being synthesized by the DNA polymerase.

But what about the other strand? The replication fork is moving in this direction, but if the -- So here is the 3 to 5 prime direction here. So if the DNA polymerase is going to be copying this strand it's going to be moving backwards to the direction of the replication fork. Now, I guess evolution and nature could have selected for two types of DNA polymerases, one that copies 5 prime to 3 prime and one that copies in the opposite direction. But it didn't. And there are a number of theoretical reasons that we could discuss in a more advanced course perhaps for why that is true. But, in fact, what it does is it uses the same polymerase. So as these things peel apart the polymerase works in the other direction, but there's another problem. If I just peel it apart like this there's no 3 prime hydroxyl. So it took people quite a few years to figure out the strategy that's used in nature. Nature has a special enzyme that makes a little piece of RNA. It's called an RNA primer. And what it does is it provides a 3 prime hydroxyl.

And once you have the 3 prime hydroxyl at the end of the little RNA chain then the DNA polymerase -- -- can be made 5 prime to 3 prime.

So as you peel open the replication fork then little pieces of RNA are used to make a new strand of DNA and it goes this way.

Now that obviously doesn't give you a new intact DNA strand.

And part of the clue to this working out what was going on at DNA This strand is pretty easy to do, but what the cells have to do now is replication was the recognition that newly synthesized DNA was made as they've got these little RNA primers. little pieces. And then later it got joined into

And then they remove the RNA by an longer pieces. And the person who discovered this was Okazaki. So these fragments of DNA that are synthesized initially are called Okazaki fragments, after the person who discovered this.

It was rather puzzling because when you tried to look at the synthesis of DNA you're looking at a long molecule, and you found some of the newly synthesized material was in short pieces. And as you watched over time it got longer. So the cell, I think you can sort of see from first principles what has to happen here then.

That in order to come and make -- enzyme that's capable of degrading the DNA or clipping it at the junction. And that then leaves the cell in this sort of situation where there are little tiny gaps in between these pieces of DNA. But at the end of each one of these is a 3 prime hydroxyl. So another polymerase or one or another polymerase in the cell can fill those little pieces of DNA out. And then there's one little nick that needs to be sealed. And so what you finally end up with is a 3 prime hydroxyl here, a 5 prime phosphate that's at the other end, and then these are joined together. This is one nucleotide here and the other here. These are then joined together to give the ordinary phosphodiester bond that links -- -- the two nucleotides together like that. And the enzyme that does that is an enzyme called DNA ligase.

You can almost think about it as DNA Scotch tape that will take a little nick in DNA, if we've got a phosphate and hydroxyl, and it will join them together.

So this process of replication, which can go at about a thousand nucleotides a second with this amazing degree of accuracy, uses two different DNA polymerases, both of which biochemically can only go in one direction. But you can see they have to be somehow oriented so that one of them is able to move in this direction and the other one is able to move in that direction.

The key part in this sort of the course is to try and understand this 5 to 3 prime and to get this basic idea that nature had to do something.

It was fairly easy to copy one strand because that was sort of the direction of the polymerase movement was the same as the replication for it movement, but the other strand had to have been much more a problem. And so when you get down to a biochemical level, though, it's very conceptually easy to say, oh, you've got complimentary strands so we just take it apart, we take the photograph and the negative and we make the opposite one and now we've got two copies. When you get down to the biochemical details there is this major biochemical issue of whether the polymerase can go in the 3 prime or the 5 prime direction.

And nature has chosen to do it all or has been selected to do it all somehow with a polymerase going in one direction.

There are many other aspects to DNA replication. And one of the tricks that I find most fascinating is that these polymerases, once they get on DNA they stay on. And that's part of the secret because it takes about a millisecond to add a nucleotide, but if it comes off the DNA it has to get back on. Then it takes about a minute. So the whole trick to being a very, very fast DNA polymerase is to somehow hang onto the DNA.

So what biochemists did was they purified the actual enzymatic activity that could carry out this process, and then they started to look for other protein factors that would help the process to work better. And they discovered something called a processivity factor which made the polymerase stay on the DNA.

And people wondered for a lot of years how that worked and why did this system work so well. And finally the crystal structure of the processivity factor was discovered. And if I go back to this sort of diagram where this is the piece of DNA that's copied, what it turned out was that the processivity factor is basically a doughnut that kind of gets clamped around the DNA like that.

So it's sort of like taking a washer with a place where you can pry it apart opening it up, putting it around the DNA like this.

And then the polymerase, more or less since this is topologically linked to the DNA, is like a washer sliding on a wire.

This DNA polymerase hangs onto that and it doesn't come off.

And I think there's a little picture of it.

Here's a little movie. There's the DNA going through and this is one of these clamps. It's virtually the same structure in a bacterium and inside of us. But, in fact, the amino acids are almost all different. But the underlying structure of the protein is almost identical. And there are special machines called clamp loaders that pry open this clamps, clamp them around DNA, and that's part of the secret to how these polymerases are able to polymerize DNA so fast. There are a lot of other pieces of this machinery. If you go on you'll hear more about them. I just want to give you one of the most recent insights.

I mean this, as you might guess, since DNA replication is at the heart of life it's been studied very, very hard, ever since the discovery of DNA helix. My colleague, Alan Grossman, made quite a discovery just probably three or four years ago.

He took that green fluorescent protein that we've seen a few times, and he actually joined the gene encoding green fluorescent protein to the backend of a piece of the DNA polymerase.

So wherever the DNA polymerase went now there was a little fluorescent molecule. And he looked to see where it was in the cell.

And I, like many other people, had for years taught, and this is why, you know, I have respect for the fact that I'm just teaching you the current model. For much of my career I taught, so DNA polymerase is sort of like a train going down the tracks a thousand molecules per second. And we're doing all this stuff with the leading and with the two strands. So let me just put those words up while I'm up there. This one is called, this strand that's easy to replicate is called the leading strand.

And this one where you have to do the primer and whatnot is called the lagging strand. In any case, what I had taught was that polymerase was like a train running on tracks.

You could calculate how fast it would move. What Alan, to his amazing I imagine, found was when he looked to see where the DNA polymerase was, it wasn't spread out all over the cell as if you thought it was a thing running on tracks.

In fact, it was in the center of the cell. And then late in cell division it split into two spots that went to the midpoints of what would be the daughter cells. And so what he ended up realizing from that was that instead it was more as if the polymerase was a factory and it pulled the DNA through it rather than it traveling down the tracks of the DNA. And that was a very surprising discovery that went against all the dogma and all the pictures in the textbook. And it was a discovery at MIT.

That was published in, I think it was 2001, something like that, a very recent discovery. Things keep changing. That's again why I keep emphasizing I cannot teach you a fact in biology.

I can teach you the best understanding we have that explains the experiments to date. But somebody may make a discovery tomorrow. That means we'll have to change our understanding.


تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

In 1983, Kary Mullis invented the polymerase chain reaction (PCR).

The basic principle under laying this technique is that when a double stranded DNA molecule is heated to a high temperature, the two DNA strands separate giving rise to single stranded DNA molecules which can be made to hybridize with small oligonucleotide primer (single stranded) by bringing down the temperature. If to this an enzyme called DNA polymerase and nucleotide tri phosphate is added, much like what happen during replication i.e. primer extension occurs.

This event is repeated several times therefore original DNA strand is produced in multiple copies. Due to reaction in several cycle, it is called polymerase chain reaction (PCR).

The basic requirements of PCR reactions are:

  • DNA template to be amplified.
  • Primers which are oligonucleotides, usually 10-18 nucleotides long, that hybridize to the target DNA, one to each strand of DNA.
  • DNA polymerase enzyme which is stable at temperature above 80˚C. Taq polymerase which has been isolated from a thermostable bacterial species, ثيرموس أكواتيكوس, is used.
  • Deoxynucleotide triphosphate and PCR buffer.

WORKING MECHANISM OF PCR:

The action of PCR includes several cycles. A single PCR amplification cycle involves these basic steps:

DENATURATION:

The two strands of DNA are separated by applying a high temperature (95˚C). After separation each strand acts as template for DNA synthesis.

PRIMER ANNEALING:

Each single strand anneals with a primer at a lower temperature between 50˚ – 60˚in such a way that extension can occur from it in a 5’-3’ direction. The annealing temperature (in ˚C) can be calculated using the formula- T= 2(AT) + 4(G+C).

EXTENSION (POLYMERISATION):

In this step, the enzyme Taq Polymerase extends each primer using dNTPs and the DNA strand as template. The temperature for extension is around 70˚C.

The procedure is repeated and each set of steps is considered as one cycle (i.e. denaturation, annealing and extension). At the end of one cycle two DNA molecules becomes four and this geometric progression occurs with each cycle.

Always after n number of cycles, 2 n molecules of DNA are generated using single stranded DNA as template.

APPLICATIONS OF PCR:

The invention of PCR technique has revolutionized every aspect of modern biology.


How DNA Works

­DNA carries the information for making all of the cell's proteins. These pro­teins implement all of the functions of a living organism and determine the organism'­s characteristics. When the cell reproduces, it has to pass all of this information on to the daughter cells.

Before a cell can reproduce, it must first replicate, or make a copy of, its DNA. Where DNA replication occurs depends upon whether the cells is a prokaryotic or a eukaryote (see the RNA sidebar on the previous page for more about the types of cells). DNA replication occurs in the cytoplasm of prokaryotes and in the nucleus of eukaryotes. Regardless of where DNA replication occurs, the basic process is the same.

The structure of DNA lends itself easily to DNA replication. Each side of the double helix runs in opposite (ضد الموازية) directions. The beauty of this structure is that it can unzip down the middle and each side can serve as a pattern or template for the other side (called semi-conservative replication). However, DNA does not unzip entirely. It unzips in a small area called a replication fork, which then moves down the entire length of the molecule.

  1. انزيم يسمى جريز الحمض النووي makes a nick in the double helix and each side separates
  2. انزيم يسمى هيليكس unwinds the double-stranded DNA
  3. Several small proteins called single strand binding proteins (SSB) temporarily bind to each side and keep them separated
  4. An enzyme complex called بوليميريز الحمض النووي "walks" down the DNA strands and adds new nucleotides to each strand. The nucleotides pair with the complementary nucleotides on the existing stand (A with T, G with C).
  5. A subunit of the DNA polymerase proofreads the new DNA
  6. انزيم يسمى ligase DNA seals up the fragments into one long continuous strand
  7. The new copies automatically wind up again

Different types of cells replicated their DNA at different rates. Some cells constantly divide, like those in your hair and fingernails and bone marrow cells. Other cells go through several rounds of cell division and stop (including specialized cells, like those in your brain, muscle and heart). Finally, some cells stop dividing, but can be induced to divide to repair injury (such as skin cells and liver cells). In cells that do not constantly divide, the cues for DNA replication/cell division come in the form of chemicals. These chemicals can come from other parts of the body (hormones) or from the environment.

The DNA of all living organisms has the same structure and code, although some viruses use RNA as the information carrier instead of DNA. Most animals have two copies of each chromosome. In contrast, plants may have more than two copies of several chromosomes, which usually arise from errors in the distribution of the chromosomes during cell reproduction. In animals, this type of error usually causes genetic diseases that are usually fatal. For some unknown reasons, this type of error is not as devastating to plants.


شاهد الفيديو: الحمض النووي الرايبوزي RNA (قد 2022).