معلومة

هل يمكن لدبوس الشعر (حلقة جذعية) داخل مربط نسخ أن يوقف ريبوسوم حقيقيات النوى؟

هل يمكن لدبوس الشعر (حلقة جذعية) داخل مربط نسخ أن يوقف ريبوسوم حقيقيات النوى؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هل تسبب دليلهم على وجود بنية ثانوية للحمض النووي الريبي (RNA) في توقف الترجمة داخل خلية حقيقية النواة؟


هل يمكن لدبوس الشعر (حلقة جذعية) داخل مربط نسخ أن يوقف ريبوسوم حقيقيات النوى؟

يبدو أن هذا يمكن أن يحدث. ترجمة C9orf72 هي أحد الأمثلة. في هذا الجين ، توجد تكرارات GGGGCC في 5 'UTR من mRNA (المنبع من ATG الأول). تتوسع التكرارات في مجموعات فرعية من اضطراب التنكس العصبي مثل ALS. يمكن أن تشكل التكرارات بنية حلقة جذعية وتكون الحلقات الجذعية للتكرارات الممتدة أكثر استقرارًا.

يبدو أن mRNAs ذات التكرارات الموسعة تنتج ببتيدات poly-GlyAla و poly-GlyPro و poly-GlyArg وهي أكواد GGG-GCC و GGG-CCG و GGC-CGG من إطارات مختلفة من تكرار GGGCC.

هذا يعني أن الترجمة تبدأ في مكان ما في التكرار أو قبله بدون ATG. لشرح ذلك ، هناك تكهنات بأن الريبوسومات تتعطل بسبب الهيكل الضيق للحلقة الجذعية من خلال تكرار GGGGCC الموسع ، واتخاذ tRNAs عن طريق الخطأ وبدء الترجمة. يطلق عليه "ترجمة غير مرتبطة بـ ATG".

قد ترغب في الرجوع إلى: الترجمة غير AUG المرتبطة بالتكرار وتأثيرها في مرض التنكس العصبي. https://sites.tufts.edu/als/the-answer/c9orf72/ ترجمة RAN وتحويل الإطارات باعتبارها تحديات متعدية عند التكرارات البسيطة للاضطرابات التنكسية العصبية البشرية


ملخص

على الرغم من ظهور عدد كبير من النماذج البلورية بالأشعة السينية للريبوسوم البكتيري 70S خلال العقد الماضي ، لا يزال النموذج الذري الدقيق للريبوسوم 80S حقيقي النواة غير متاح. تمتلك الريبوسومات حقيقية النواة عددًا أكبر من البروتينات الريبوزومية والحمض النووي الريبي الريبوسومي أكثر من الريبوسومات البكتيرية ، والتي تشارك في وظائف خارج الجسم في الخلايا حقيقية النواة. من خلال الجمع بين cryo-EM مع RNA ونمذجة تجانس البروتين ، حصلنا على نموذج ذري لريبوسوم الخميرة 80S كاملًا مع جميع قطاعات تمدد RNA الريبوزومي وجميع بروتينات الريبوسوم التي يمكن تحديد متماثل هيكلي لها. يمكن لطفرة أو حذف بروتينات الريبوسوم 80S أن تلغي نضوج الريبوسوم ، مما يؤدي إلى العديد من الأمراض البشرية. لقد حددنا بروتينًا فريدًا من نوعه في حقيقيات النوى ، وهو rpS19e ، الذي ترتبط طفراته بفقر الدم Diamond-Blackfan في البشر. بالإضافة إلى ذلك ، فإننا نصنف التفاعلات الحاسمة بين قاعدة الساق الديناميكية للريبوسوم مع عامل استطالة حقيقيات النوى 2.

العنوان الحالي: Department of Pharmacology، Case Western Reserve University، Cleveland، OH 44106-4965، USA

العنوان الحالي: التعاون البحثي للبيولوجيا الإنشائية ، روتجرز ، جامعة ولاية نيو جيرسي ، قسم الكيمياء والبيولوجيا الكيميائية ، بيسكاتواي ، نيوجيرسي 08854-8087 ، الولايات المتحدة الأمريكية

العنوان الحالي: معهد البيولوجيا التركيبية والجزيئية ، كلية علم البلورات ، كلية بيركبيك لندن ، لندن WC1E 7HX ، المملكة المتحدة


الملخص

عندما يكون كودون التوقف في موقع 80S الريبوسوم A ، هناك ستة نيوكليوتيدات (+4 إلى +9) في اتجاه مجرى النهر والتي يُستنتج أنها تحتل قناة mRNA. درسنا تأثير هذه النيوكليوتيدات المصب على نجاح إنهاء الترجمة أو فشلها في خلايا الثدييات في أكواد التوقف الثلاثة. لوحظ التسلسل الهرمي المتوقع في الدقة الجوهرية لكودونات التوقف (UAA & gtUAG & gt & gtUGA) ، مع تأثيرات مؤثرة للغاية على قراءة الإنهاء بوساطة النيوكليوتيدات في الموضع +4 والموضع +8. لوحظ تأثير أكثر تعقيدًا من النيوكليوتيدات في المواضع +5 و +6. كانت أضعف سياقات الإنهاء هي الأكثر تأثرًا بالزيادات أو النقصان في تركيز عامل تحرير فك التشفير (eRF1) ، مما يشير إلى أن ارتباط eRF1 بهذه الإشارات كان محددًا للمعدل. عندما تم تقليل كفاءة الإنهاء بشكل كبير بواسطة الحمض الريبي النووي النقال القامع ، تم الحفاظ على التأثير الملحوظ للنيوكليوتيدات المصب. كان هناك ارتباط إيجابي بين قوة الإشارة المقاسة تجريبياً وتردد الإشارة في جينومات حقيقيات النوى ، لا سيما في خميرة الخميرة و ذبابة الفاكهة سوداء البطن. نقترح أن كفاءة الإنهاء لا تتأثر فقط باستجواب إشارة التوقف مباشرة بواسطة عامل الإطلاق ، ولكن أيضًا بالتفاعلات الريبوزومية في اتجاه مجرى النهر مع نيوكليوتيدات الرنا المرسال في قناة الدخول.


3. النتائج

3.1 تغيير قوة التعبير باستخدام هياكل 5′UTR RNA

العمل الأخير في S. cerevisiae أظهر أن هياكل دبوس الشعر داخل 5′UTR من mRNAs تقلل من التعبير عن طريق تثبيط الترجمة (22). للتحقق أولاً من هذا الاكتشاف ، استخدمنا طرق الاستنساخ ذات وعاء واحد لتقديم مكتبة من هياكل دبوس الشعر في 5′UTR من تعبير ترميز mRNA لبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) من مروج GAL1 الذي يحفز الجالاكتوز. باستخدام إستراتيجية تضخيم PCR باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيد المتدهورة ، متبوعًا بالاستنساخ باستخدام نظام YTK المعياري ، قدمنا ​​مكتبة دبوس شعر متباعدة بين 15 قاعدة في بداية كودون GFP ، كما تم تلخيصه في الشكل 1 ومفصل في الشكل التكميلي S1. لتصميم تسلسلات ترميز دبوس الشعر ، استخدمنا RNAfold من مجموعة أدوات ViennaRNA ، لأنها تسمح لخوارزميات RNAfolding بالعمل على كمبيوتر محلي ويمكن تعديل المعلمات الديناميكية الحرارية للعمل عند 30 درجة مئوية (14 ، 40). كاختبار أولي ، تم تصميم زوجين من بادئات قليلة النوكليوتيد المتدهورة لإنشاء مكتبتين بديلتين للهيكل الثانوي ، باستخدام إستراتيجية تصميم تضمن عدم إدخال أكواد AUG السابقة لأوانها من أجل تجنب تشكيل uORF. تقوم البادئات معًا بترميز إدخال 60 قاعدة للتسلسل الذي تنبأ به RNAfold ليتم طيها في شكل دبوس شعر قوي من 27 قاعدة أساسية مع أربع حلقات أساسية ، موضوعة في أعلى منطقة Kozak (الشكل 1A).

Nby9qm4hx2K4bea6SHCWIvi-VRKZ5OOWkC26-791OdDdr6I8t52VVNpK6oFk5BLnwTEBTIOSQYlwAvYpNG "/>

نظرة عامة على إنشاء مكتبة HL1 و HL2 لمكتبة 5′UTR. (أيتم إدخال النيوكليوتيدات المنحلة في مواضع مختلفة في تصميم سقالة دبوس الشعر. (ب) يتم حساب MFE لجميع التسلسلات الممكنة باستخدام RNAfold وتصور في الرسم البياني. ثم يتم استخدام هذه القيم للتنبؤ بملف تعريف التعبير للمكتبة الناتجة. إذا لزم الأمر ، يتم تعديل تكوين وموقع النيوكليوتيدات المتحللة لإنتاج التوزيع المطلوب لمستويات التعبير. (ج) عندما يفي التصميم بالمتطلبات ، يتم طلب مواد أولية تتضمن التنكسات المطلوبة. مكتبة البلازميدات ل الإشريكية القولونية يتم إنشاء التحول باستخدام PCR وخطوة تجميع قائمة على Golden Gate لاحقة يتم تنفيذها بتنسيق YTK. مكتبة بكتريا قولونية يتم حصاد المحولات وتهيئة البلازميدات لتحويل الخميرة. (د) يتم تجميع مستعمرات الخميرة المحولة وتحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي. يتم التخلص من الحيوانات المستنسخة التي لا تظهر التألق الأحمر التأسيسي في مراقبة الجودة من أجل التجميع الصحيح. ينعكس تنوع مكتبة دبابيس الشعر في انتشار التألق الأخضر على ثلاث مرات من حيث الحجم. كمرجع ، يتم عرض توزيع البنية الأصلية باللون الأخضر الفاتح ويتم تطبيعها باستخدام محور ثانوي. يتم عرض مقارنة ما قبل التطبيع في الشكل التكميلي S2.

Nby9qm4hx2K4bea6SHCWIvi-VRKZ5OOWkC26-791OdDdr6I8t52VVNpK6oFk5BLnwTEBTIOSQYlwAvYpNG "/>

نظرة عامة على إنشاء مكتبة دبوس الشعر 5′UTR HL1 و HL2. (أيتم إدخال النيوكليوتيدات المنحلة في مواضع مختلفة في تصميم سقالة دبوس الشعر. (ب) يتم حساب MFE لجميع التسلسلات الممكنة باستخدام RNAfold وتصور في الرسم البياني. ثم يتم استخدام هذه القيم للتنبؤ بملف تعريف التعبير للمكتبة الناتجة. إذا لزم الأمر ، يتم تعديل تكوين وموقع النيوكليوتيدات المتحللة لإنتاج التوزيع المطلوب لمستويات التعبير. (ج) عندما يفي التصميم بالمتطلبات ، يتم طلب مواد أولية تتضمن التنكسات المطلوبة. مكتبة البلازميدات ل الإشريكية القولونية يتم إنشاء التحويل باستخدام PCR وخطوة تجميع قائمة على Golden Gate لاحقة يتم تنفيذها بتنسيق YTK. مكتبة بكتريا قولونية يتم حصاد المحولات وتهيئة البلازميدات لتحويل الخميرة. (د) يتم تجميع مستعمرات الخميرة المحولة وتحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي. يتم التخلص من الحيوانات المستنسخة التي لا تظهر التألق الأحمر التأسيسي في مراقبة الجودة من أجل التجميع الصحيح. ينعكس تنوع مكتبة دبابيس الشعر في انتشار التألق الأخضر على ثلاث مرات من حيث الحجم. كمرجع ، يتم عرض توزيع البنية الأصلية باللون الأخضر الفاتح ويتم تطبيعها باستخدام محور ثانوي. يتم عرض مقارنة ما قبل التطبيع في الشكل التكميلي S2.

تم تصميم النيوكليوتيدات المتحللة في 10 مواضع داخل البادئات بحيث يكون للتركيبات المختلفة الناتجة عن الاستنساخ تباين في القواعد داخل جذع دبوس الشعر ، وبالتالي ، مجموعة من نقاط القوة للهيكل الثانوي للحمض النووي الريبي الناتج. باستخدام RNAfold ، يمكن تحديد توزيع الحد الأدنى المتوقع من الطاقات الحرة القابلة للطي لكل من مكتبتي دبوس الشعر عن طريق حساب قوة الطي لجميع المجموعات الممكنة من القواعد المتدهورة المقدمة (الشكل 1 ب). تم تصميم المكتبتين الأوليتين ، كل منهما تحتوي على 10 قواعد متدهورة لإعطاء توزيع طبيعي لقوى البنية الثانوية المتوقعة بمتوسط ​​MFE للطي بمقدار 32.2 kcal / mol و −28.8 kcal / mol (المكتبات HL1 و HL2 ، على التوالي ، انظر الجدول التكميلي 1). S9 للتسلسلات).

أثناء بناء مكتبة البلازميد ، تم تجميع جميع المستعمرات لكل مكتبة ، ثم تم تحويلها إلى S. cerevisiae ثم تم تجميع جميع مستعمرات الخميرة من كل مكتبة. نمت المكتبات المجمعة في وسائط الجالاكتوز للحث على التعبير الجيني وتم قياس التألق الأخضر لكل خلية لـ 10000 خلية من كل مكتبة عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 1C). لكل من مكتبات HL1 و HL2 ، شوهد أن التألق الأخضر الطبيعي يختلف عبر السكان بأكثر من ثلاثة أوامر من حيث الحجم (الشكل 1 د) ، مما يشير إلى أن وحدات دبوس الشعر كانت تغير بالفعل تعبير GFP في الخلايا بشكل كبير مقارنة ببنية مكافئة مع لا توجد وحدة دبوس الشعر (الشكل التكميلي S2). اختلف أيضًا شكل وقمة الرسوم البيانية الفلورية في الحالتين ، حيث أظهر المزيد من الخلايا كميات منخفضة من تعبير GFP عندما تم استخدام المكتبة ذات الهيكل الثانوي المتوقع الأقوى (HL1).

3.2 مطابقة مستويات التعبير لطاقات الطي المتوقعة

سعينا بعد ذلك إلى تحديد العلاقة بين MFE المتوقع للهياكل الثانوية 5′UTR المشفرة والنتيجة في الجسم الحي مستويات التعبير GFP بتنسيق S. cerevisiae. اخترنا بشكل عشوائي 31 مستعمرة فردية من مكتباتنا ، وحددنا تسلسل مناطق 5 -UTR الخاصة بهم واستخدمنا قياس التدفق الخلوي لتوصيف تعبير GFP لكل خلية عند الاستقراء. استخدمنا RNAfold للتنبؤ بـ MFE لهياكل دبوس الشعر في كل عزلة عن طريق إدخال تسلسل 5′UTR. قمنا بعد ذلك برسم العلاقة بين MFE المتوقع وتعبير GFP الطبيعي الذي كشف عن علاقة واضحة بين طاقة UTR القابلة للطي المتوقعة وتعبير GFP لكل مستعمرة معزولة (الشكل 2 أ). الهياكل الضعيفة مع MFE أعلى من -22 kcal / mol لا تعطي انخفاضًا قابلاً للقياس في التعبير ، ولكن مع انخفاض قيم MFE بشكل أكبر ، يُلاحظ انخفاض حاد في تعبير GFP ، بما يتماشى مع الفرضية القائلة بأن الهياكل الثانوية القوية بشكل متزايد في 5′UTR تمنع التعبير الجيني. للتأكد من أن الانخفاض يرجع إلى انخفاض الترجمة بدلاً من النسخ المنخفض ، استخدمنا qPCR للتحقق من أن مستويات النسخ الخاصة بنا لكل خلية تظل كما هي ، على الرغم من إدخال تسلسلات مختلفة من دبوس الشعر 5′UTR (الشكل التكميلي S3).

العلاقة بين قوة دبوس الشعر 5′UTR وتعبير البروتين. تظهر دبابيس الشعر الأقوى أنها تسبب تعبيرًا أقل بطريقة يمكن التنبؤ بها. (أ) تحديد وظيفة النقل بين طاقة طي دبوس الشعر والفلورة الخضراء الطبيعية. تم قياس الإسفار لـ 31 من أعضاء مكتبة HL1 و HL2 المعزولين وقسمتهم على مضان تلقائي متوسط ​​لسلالة الوالدين للحصول على التألق الطبيعي. تم تسلسل العزلات للحصول على متواليات 5′UTR ، والتي تم استخدامها لحساب طاقة طي دبوس الشعر المقابلة. يوضح الرسم البياني طاقة الطي لـ 5′UTR لكل عزلة مرسومة مقابل التألق الأخضر الطبيعي ومجهزة بمنحنى نمو لوجستي. يتم سرد التسلسلات والقيم التي تم الحصول عليها في الجدول التكميلي S5. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري لمتوسط ​​ثلاثة قياسات لكل منها 10000 حدث. (ب) معادلة تصف التوافق اللوجستي بين طاقة الطي المتوقعة والفلورة الطبيعية. (ج) رسم تخطيطي لوحدة النسخ التي تشكل مكتبة دبوس الشعر RNA. تشكل المنطقة الوردية العمود الفقري لدبابيس الشعر مع وجود كرات حمراء تشير إلى النيوكليوتيدات المتدهورة. (د) العلاقة بين القوة المتوقعة لمكتبات بنية 5′UTR وتوزيعات التعبير الجيني المقاسة لهذه المكتبات. تعرض جميع اللوحات توزيعات تردد طبيعية (رسوم بيانية). يتم عرض ما مجموعه ست مكتبات (HL1-6) ، والتي يُعطى متوسط ​​MFE للطي بالكيلو كالوري / مول. في الصف العلوي من اللوحات ، يظهر الرسم البياني لتوزيع MFE في 5 -UTRs للمكتبات المختلفة. تتراوح المحاور الأفقية لهذه الألواح على مقياس خطي من -50 كيلو كالوري / مول إلى 0 كيلو كالوري / مول. يحول الصف الأوسط هذه إلى رسم بياني لمستويات التعبير الطبيعي المتوقعة باستخدام المعادلة المحددة في اللوحة أ. يوضح الصف الثالث التوزيع الذي تم الحصول عليه تجريبياً لمستويات تعبير مراسل الفلورسنت الطبيعي كما تم قياسه بواسطة قياس التدفق الخلوي. في الصفين السفليين ، يتوافق المحور الأفقي مع التألق الأخضر الطبيعي (كمية أقل من وحدة) تتراوح على مقياس لوغاريتمي من 1 على اليسار إلى 1000 على اليمين.

العلاقة بين قوة دبوس الشعر 5′UTR وتعبير البروتين. تظهر دبابيس الشعر الأقوى أنها تسبب تعبيرًا أقل بطريقة يمكن التنبؤ بها. (أ) تحديد وظيفة النقل بين طاقة طي دبوس الشعر والفلورة الخضراء الطبيعية. تم قياس الإسفار لـ 31 من أعضاء مكتبة HL1 و HL2 المعزولين وقسموا على مضان تلقائي متوسط ​​لسلالة الوالدين للحصول على التألق الطبيعي. تم تسلسل العزلات للحصول على متواليات 5′UTR ، والتي تم استخدامها لحساب طاقة طي دبوس الشعر المقابلة. يوضح الرسم البياني طاقة الطي لـ 5′UTR لكل عزلة مرسومة مقابل التألق الأخضر الطبيعي ومجهزة بمنحنى نمو لوجستي. يتم سرد التسلسلات والقيم التي تم الحصول عليها في الجدول التكميلي S5. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري لمتوسط ​​ثلاثة قياسات لكل منها 10000 حدث. (ب) معادلة تصف التوافق اللوجستي بين طاقة الطي المتوقعة والفلورة الطبيعية. (ج) رسم تخطيطي لوحدة النسخ التي تشكل مكتبة دبوس الشعر RNA. تشكل المنطقة الوردية العمود الفقري لدبابيس الشعر مع وجود كرات حمراء تشير إلى النيوكليوتيدات المتدهورة. (د) العلاقة بين القوة المتوقعة لمكتبات بنية 5′UTR وتوزيعات التعبير الجيني المقاسة لهذه المكتبات. تعرض جميع اللوحات توزيعات تردد طبيعية (رسوم بيانية). يتم عرض ما مجموعه ست مكتبات (HL1-6) ، والتي يُعطى متوسط ​​MFE للطي بالكيلو كالوري / مول. في الصف العلوي من اللوحات ، يظهر الرسم البياني لتوزيع MFE في 5 -UTRs للمكتبات المختلفة. تتراوح المحاور الأفقية لهذه الألواح على مقياس خطي من -50 كيلو كالوري / مول إلى 0 كيلو كالوري / مول. يحول الصف الأوسط هذه إلى رسم بياني لمستويات التعبير الطبيعي المتوقعة باستخدام المعادلة المحددة في اللوحة A. ويظهر الصف الثالث التوزيع الذي تم الحصول عليه تجريبياً لمستويات تعبير مراسل الفلورسنت الطبيعي كما تم قياسه بواسطة قياس التدفق الخلوي. في الصفين السفليين ، يتوافق المحور الأفقي مع التألق الأخضر الطبيعي (كمية أقل من وحدة) تتراوح على مقياس لوغاريتمي من 1 على اليسار إلى 1000 على اليمين.

نظرًا لأن الاتجاه في الشكل 2 أ يُظهر منحنى سيني ، فقد اخترنا تعديل معادلة النمو اللوجستي لإعطاء معادلة للتنبؤ بالتعبير الجيني (مثل التألق الطبيعي) من MFE المحسوب لطي تسلسل 5′UTR والإنتاج الأقصى لـ المروج (بماكس) المستخدمة في بناء التعبير الجيني (الشكل 2 ب). في حين أن هذا المنحنى المجهز يتبع البيانات عن كثب ، لا تقع جميع نقاط البيانات ضمن فاصل الثقة 95٪ وفي أكثر الحالات تطرفًا ، تكون قيم التعبير المتوقعة 3 أضعاف أو يتم التقليل من شأنها مقارنة بالقيمة المرصودة. في حين أن هذا يوضح أن نهجنا الملائم للمنحنى لا يلتقط جميع السلوكيات بشكل كامل ، إلا أن قدرته التنبؤية لا تزال تُقارن بشكل إيجابي بالعديد من الأدوات الحالية. أعطت حاسبة RBS v1.0 انحرافات تصل إلى 10 أضعاف عن القيم المتوقعة على الرغم من استخدام نموذج مشتق لمراعاة العمليات الفيزيائية الحيوية المتعددة (8). وبالمثل ، لا يبدو أن التطابق الخطي في حاسبة yUTR (18) قريب من البيانات مثل تلك الموضحة هنا. من المحتمل أن تكون حقيقة أننا نحصر تباين 5′UTR على عدد قليل من النيوكليوتيدات الرئيسية التي تحكم قوة دبوس الشعر هي السبب وراء أداء هذا النهج البسيط بشكل جيد.

لاختبار القدرة التنبؤية لمعادلة تناسب المنحنى ، قمنا بعد ذلك ببناء واختبار أربع مكتبات أخرى (HL3-6) مصممة بحيث يكون لها متوسط ​​قوة هيكل مختلفة ضمن توزيعاتها مقارنة بـ HL1 و HL2 (الشكل 2C). تم تحديد توزيعات مستوى التعبير المتوقع لجميع أعضاء كل مكتبة من MFEs المحسوبة باستخدام المعادلة المجهزة لاستخدام مروج GAL1 من أجل Pmax. ثم تم رسم التوزيعات المتوقعة على شكل رسوم بيانية ومقارنتها بتوزيعات قياس التدفق الخلوي لمخرجات GFP لكل مكتبة خميرة. كشف هذا عن اتفاق نوعي جيد بين تنبؤات النموذج والبيانات التجريبية (الشكل 2 د). في جميع الحالات ، تطابق الرسوم البيانية للتنبؤ مع تعبير GFP المقيس المقاس في كل من انتشارها (نطاق مستويات التعبير) وموضع الذروة (متوسط ​​التعبير). يُلاحظ بعض توسيع الذروة في بيانات قياس التدفق الخلوي مقارنة بالتنبؤات ، بسبب الخلايا الصغيرة والكبيرة داخل السكان التي تسبب ضوضاء ذاتية.

للتحقق بعد ذلك من أداء الأعضاء الفرديين في هذه المكتبات كما هو متوقع ، قمنا بعزل التركيبات وتسلسلها وتميزها بشكل فردي من إحدى هذه المكتبات (HL3) ورسمنا تعبير GFP المرصود مقابل قيم MFE المتوقعة بناءً على تسلسلها (الشكل 3 أ). بصرف النظر عن أحد العوامل الخارجية ، التي نعزوها إلى طفرة فارغة في GFP ، يُنظر إلى اتفاق ممتاز بين قيم التنبؤ والقياس ، للتحقق من القدرة على ضبط التعبير الجيني بشكل متوقع عن طريق تغيير تسلسل دبوس الشعر المُدرج.

مكتبات دبوس الشعر تحافظ على القدرة على التنبؤ في سياقات وراثية مختلفة. تُظهر العزلات من ثلاث مكتبات دبوس شعر مدرجة في ثلاثة سياقات وراثية أن إمكانية التنبؤ بالتسلسلات الفردية يتم الحفاظ عليها عبر السياقات المختلفة. لكل سياق جيني ، نعرض رسمًا كاريكاتوريًا لتسلسل الحمض النووي (ليس للقياس ، الصف العلوي) ، ومقارنة بين التوزيع المتوقع والمقاس للتألق الطبيعي (الصف الأوسط) ، ومخططات التألق الطبيعي للمستعمرات المعزولة المرسومة مقابل المتوقع طاقة مجانية لطي منطقة 5′UTR بالإضافة إلى التألق المتوقع عند طاقات طي مختلفة بناءً على الحد الأقصى من مضان المروج الأصلي (الصف السفلي). (أ) عزل مكتبة HL3 في سياق مروج مشتق من GAL1 و yEGFP. تحتوي مكتبة HL3 على متوسط ​​MFE من الطي يبلغ 25.8 كيلو كالوري / مول ، لذلك نادرًا ما تكون العزلات التي تحتوي على MFE أقل من 35 كيلو كالوري / مول. (ب) عزل مكتبة HL1 في سياق مروج مشتق من GAL1 و mRuby2 RFP. متوسط ​​MFE لمكتبة HL1 هو 32.2 كيلو كالوري / مول. (ج) عزلات مكتبة HC1 في سياق محفز PGK1 و yEGFP. متوسط ​​MFE لمكتبة HC1 هو 28.9 كيلو كالوري / مول. يتم سرد التسلسلات وقيم التألق التي تم الحصول عليها في الجداول التكميلية S6 - S8 لـ (A) و (B) و (C) ، على التوالي.

مكتبات دبوس الشعر تحافظ على القدرة على التنبؤ في سياقات وراثية مختلفة. تُظهر العزلات من ثلاث مكتبات دبوس شعر مدرجة في ثلاثة سياقات وراثية أن إمكانية التنبؤ بالتسلسلات الفردية يتم الحفاظ عليها عبر السياقات المختلفة. لكل سياق جيني ، نعرض رسمًا كاريكاتوريًا لتسلسل الحمض النووي (ليس للقياس ، الصف العلوي) ، ومقارنة بين التوزيع المتوقع والمقاس للتألق الطبيعي (الصف الأوسط) ، ومخططات التألق الطبيعي للمستعمرات المعزولة المرسومة مقابل المتوقع طاقة مجانية لطي منطقة 5′UTR بالإضافة إلى التألق المتوقع عند طاقات طي مختلفة بناءً على الحد الأقصى من مضان المروج الأصلي (الصف السفلي). (أ) عزل مكتبة HL3 في سياق مروج مشتق من GAL1 و yEGFP. تحتوي مكتبة HL3 على متوسط ​​MFE من الطي يبلغ 25.8 كيلو كالوري / مول ، لذلك نادرًا ما تكون العزلات التي تحتوي على MFE أقل من 35 كيلو كالوري / مول. (ب) عزل مكتبة HL1 في سياق مروج مشتق من GAL1 و mRuby2 RFP. متوسط ​​MFE لمكتبة HL1 هو 32.2 كيلو كالوري / مول. (ج) عزلات مكتبة HC1 في سياق محفز PGK1 و yEGFP. متوسط ​​MFE لمكتبة HC1 هو 28.9 كيلو كالوري / مول. يتم سرد التسلسلات وقيم التألق التي تم الحصول عليها في الجداول التكميلية S6 - S8 لـ (A) و (B) و (C) ، على التوالي.

3.3 5′UTR دبابيس الشعر كأجزاء معيارية

لإثبات أنه يمكن تبديل دبابيس الشعر المصممة إلى تركيبات أخرى ، قمنا بعد ذلك بتبديل تسلسل ORF في بنياتنا بتعبير ترميز واحد لبروتين مختلف. لقد استبدلنا yEGFP ORF بـ mRuby2 ORF للمكتبات HL4 و HL2 و HL1 لإنشاء إصدارات من هذه المكتبات التي تعبر الآن عن بروتين فلوري أحمر (RFP). لا يحتوي mRuby ORF على تماثل تسلسل نيوكليوتيد كبير مع yEGFP ORF ، مما يعني أن سياق 5′UTR قد تغير من خلال وجود تسلسل RNA مختلف. يطابق تحليل التدفق الخلوي لتعبير طلب تقديم العروض في هذه المكتبات الجديدة عن كثب توزيعات التعبير المتوقعة (الشكل التكميلي S4 أ). علاوة على ذلك ، عندما تم تحليل التركيبات المتجانسة المختارة عشوائيًا لمكتبة HL1-RFP ، رأينا مرة أخرى اتفاقًا جيدًا بين قيم التنبؤ والقياس للتصاميم الفردية (الشكل 3 ب).

ثم قمنا بعد ذلك بتقييم الوحدة النمطية عن طريق تغيير تسلسل المروج قبل بنيات ترميز GFP الخاصة بنا. قمنا أولاً بتصميم ترميز 5′UTR لمكتبة دبوس شعر جديدة متدهورة (HC1) تم اختيارها بمتوسط ​​MFE يبلغ 28.9 كيلو كالوري / مول لضمان انتشار واسع للمخرجات مع مروجين مختلفين. تم إنشاء هذا بعد ذلك في شريط تعبير GFP واستخدم لإنشاء خمس مكتبات ، لكل منها مروج تأسيسي مختلف تم تحديد قوة تعبيره مسبقًا للحصول على معلومة معروفة بماكس. تم التنبؤ بتوزيعات التعبير للمكتبات المستندة إلى HC1 باستخدام المعادلة المجهزة على الخمسة بماكس القيم. عندما تمت مقارنة هذه التوزيعات المتوقعة بتحليل قياس التدفق الخلوي لجميع المكتبات الخمس ، شوهد مرة أخرى تطابق نوعي جيد ، خاصة بالنسبة للمروجين الأقوى (الشكل التكميلي S4 ب). للتأكيد مرة أخرى على أن هذا كان صحيحًا على المستوى الفردي ، تم تسلسل البنى متساوية المنشأ وإعادة تحليلها وأظهرت هذه الموافقة الممتازة بين مستويات التعبير المتوقعة والمقاسة (الشكل 3 ج). في حين أن هذه ليست سوى عينة صغيرة من المروجين المحتملين ، فإن النتيجة تشير إلى أن نهج دبوس الشعر 5′UTR هو معياري فيما يتعلق بالمروجين المنبع ، مما يعني أنه يمكن تطبيق النهج لتغيير التعبير من العديد من المروجين في S. cerevisiae. من المهم أن نلاحظ ، مع ذلك ، أن المروجين الضعفاء يظهرون حساسين بشكل خاص لهيكل 5′UTR القوي ، وبالتالي سيكون من الأفضل إقرانهم بالمكتبات ذات متوسط ​​قوة الطي الأضعف.

3.4 ضبط يمكن التنبؤ به للتعبير المنظم باستخدام دبابيس شعر 5′UTR

النهج الذي تم تطويره هنا لوضع الهيكل الثانوي المصمم داخل mRNA 5′UTRs يوفر أداة معيارية جديدة لتعديل التعبير الجيني. في S. cerevisiae ، الطريقة الأكثر شيوعًا لتغيير قوة التعبير الجيني هي استبدال المحفز ، ومع ذلك ، عندما يكون تنظيم الجينات مطلوبًا (على سبيل المثال للتعبير المحرض) ، يصبح الضبط في المحفز مشكلة ، حيث أن القواعد المتغيرة داخل المروج لتغيير قوة النسخ غالبًا أيضًا يغير الكفاءة التي ترتبط بها عوامل النسخ وتنظم المروج. تقدم 5 دبابيس شعر UTR حلاً لهذه المشكلة ، لأن الضبط الدقيق لإخراج التعبير يتحقق عن طريق تغيير القواعد بعيدًا عن مكان تشفير التنظيم.

لإثبات ذلك ، قمنا بمقارنة نهجنا مباشرة بمكتبة مروج منظمة مكافئة أنتجناها مسبقًا باستخدام الطفرات المستهدفة والاختيار والتوصيف (41). في كلتا الحالتين ، يتم استخدام إصدار منظم صناعيًا من محفز GAL1 حيث يقوم مثبط Lac (LacI) بقمع تعبير GFP عن طريق الارتباط بموقع الربط الخاص به الموجود داخل قلب المروج. يتم التنظيم الخارجي لهذا المروج عبر المحفز IPTG الذي يمنع مثبط LacI وبالتالي يؤدي إلى التعبير الكامل للمروج.

بالنسبة لكلتا المكتبتين ، يتم رؤية نطاق مرغوب فيه من النواتج القصوى عند تطبيق IPTG ، لكن كفاءة القمع تختلف بشكل كبير بالنسبة لمكتبة المروج ، حيث يكون العديد من المروجين متسربًا بشكل خاص (الشكل 4 أ). في المقابل ، يظهر جميع الأعضاء من مكتبة دبوس الشعر 5′UTR خصائص التعبير المطلوب ، مع القمع غير المتأثر وتنبؤات مطابقة الإخراج المستحثة (الشكل 4 ب). علاوة على ذلك ، تم إنشاء هذه المكتبة المكونة من 45 عضوًا في أقل من أسبوع مع وجود ثلاث مستعمرات فقط من 48 بحاجة إلى التخلص منها بسبب عدم وجود تعبير. في المقابل ، كانت طريقة الطفرات المحفزة المستخدمة سابقًا تتطلب 2-3 أسابيع وفرز أكثر من 300 مستعمرة لعزل المكتبة المتدرجة المكونة من 21 عضوًا (41).

مقارنة بين طرق إنشاء مكتبة التعبير المنظم. تحتوي المحفزات المنظمة القائمة على GAL1 على موقع مشغل لاك اصطناعي يمكن ربطه بـ Lac Repressor (LacI) من أجل قمع المروج. يمكن إضافة IPTG لاحقًا لتحرير LacI من الحمض النووي ، وعكس تأثيره القمعي وتحفيز تعبير yEGFP. (أ) النتائج وطريقة استخدام الطفرات العشوائية المستهدفة. في هذا النهج ، يتم اختيار المناطق المحددة في المروج الأساسي (الكتل الرمادية) بشكل عشوائي تمامًا. من بين مجموعة مكونة من 350 مرشحًا ، تم تحديد أفضل 20 نتيجة أداءً (L1 – L20) والإصدار غير المتحور (LX). تمثل أشرطة الخطأ الخطأ المعياري لمتوسط ​​ثلاث تكرارات بيولوجية. (ب) نتائج وطريقة استخدام 5′UTR دبابيس الشعر كما تم تطويرها في هذا العمل. يتم وضع تسلسل مكتبة دبوس الشعر (HG1) الذي يحتوي على نيوكليوتيدات متحللة مباشرة بعد موقع بدء النسخ ويسبق كودون البدء. من الحيوانات المستنسخة الناتجة ، يتم اختيار 45 وتمييزها مباشرة ، دون خطوة فرز مسبقة. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري لمتوسط ​​ثلاث تكرارات بيولوجية.

مقارنة بين طرق إنشاء مكتبة التعبير المنظم. تحتوي المحفزات المنظمة القائمة على GAL1 على موقع مشغل لاك اصطناعي يمكن ربطه بـ Lac Repressor (LacI) من أجل قمع المروج. يمكن إضافة IPTG لاحقًا لتحرير LacI من الحمض النووي ، وعكس تأثيره القمعي وتحفيز تعبير yEGFP. (أ) النتائج وطريقة استخدام الطفرات العشوائية المستهدفة. في هذا النهج ، يتم اختيار المناطق المحددة في المروج الأساسي (الكتل الرمادية) بشكل عشوائي تمامًا. من بين مجموعة مكونة من 350 مرشحًا ، تم تحديد أفضل 20 نتيجة أداءً (L1 – L20) والإصدار غير المتحور (LX). تمثل أشرطة الخطأ الخطأ المعياري لمتوسط ​​ثلاث تكرارات بيولوجية. (ب) نتائج وطريقة استخدام 5′UTR دبابيس الشعر كما تم تطويرها في هذا العمل. يتم وضع تسلسل مكتبة دبوس الشعر (HG1) الذي يحتوي على نيوكليوتيدات متحللة مباشرة بعد موقع بدء النسخ ويسبق كودون البدء. من الحيوانات المستنسخة الناتجة ، يتم اختيار 45 وتمييزها مباشرة ، دون خطوة فرز مسبقة. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري لمتوسط ​​ثلاث تكرارات بيولوجية.


الانتماءات

مارك غرايل موجود في معهد Biochimie et Biophysique Moléculaire et Cellulaire (IBBMC) ، المركز الوطني للبحث العلمي (CNRS) ، UMR8619 ، Bat 430 ، Université Paris Sud ، F-91405 Orsay Cedex ، France ، وفي Laboratoire de Biochimie ، CNRS، UMR 7654، Ecole Polytechnique، F-91128 Palaiseau Cedex، France.

بيرتراند سيرافين موجود في Equipe Labellisée La Ligue ، Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC) ، Illkirch F-67400 ، فرنسا ، في CNRS ، UMR7104 ، Illkirch F-67404 ، فرنسا ، في Inserm ، U964 ، Illkir -67400 ، فرنسا ، وجامعة ستراسبورغ ، ستراسبورغ F-67000 ، فرنسا.


4. آفاق المستقبل

نظرًا للطبيعة غير المتزامنة للتفاعلات العشوائية ، غالبًا ما يكون من الصعب استنتاج الآليات الجزيئية التفصيلية من تجارب الحجم التقليدية. ومع ذلك ، فقد أوضحت التطورات الحديثة للأدوات الفيزيائية الحيوية ، وخاصة تقنيات الجزيء الواحد ، الكثير حول الخصائص الميكانيكية والوظيفية للعقدة الكاذبة [31 ، 32 ، 41 ، 44] ، وتأثير الهيليكس الريبوزومي [46 ، 78] ، والآليات. آلية الترجمة ككل [52 ، 76 ، 79 ، 80]. في الواقع ، فإن الجمع بين البيانات من cryo-EM ، وعلم البلورات بالأشعة السينية ، بالإضافة إلى محاكاة / نمذجة الديناميكيات الجزيئية قد وفر تنبؤات ورؤى حول التفاعلات بين ساق الريبوسوم L1 و tRNAs ، والتي تتفق جيدًا مع نتائج smFRET [80]. من المغري أن نسأل عما يمكن أن نتعلمه من خلال تطبيق منهجيات مشتركة مماثلة على تحقيقات & # x022121 آليات PRF.

المناهج الهيكلية والحسابية والجزيء الواحد مكملة لبعضها البعض. تكشف النمذجة والمحاكاة الحسابية عن الطبيعة الديناميكية للجزيئات وتوفر طرقًا قائمة على الفيزياء لتشوهات البروتين في وجود قوى مطبقة خارجيًا [69 ، 73 ، 81 ، 82]. يمكن أن تجعل الحسابات & # x0201crational & # x0201d وسم البيوتين / الديجوكسيجينين ممكنًا في تجربة جزيء واحد ، عن طريق وضع العلامات على الريبوسوم في المواقع التي تسبب أقل التغييرات المطابقة والتفكك الناتج عن mRNA أثناء النتف البصري. يمكن أن تكون الأوصاف الميكانيكية لها ذات صلة من الناحية الفسيولوجية ، كما في حالة titin kinase ، الذي يعمل كمستشعر للقوة الجزيئية في خلايا العضلات [81 & # x0201383]. من ناحية أخرى ، تتحقق قوة الجزيء المفرد والمطياف الفلوري من التحولات الهيكلية في الوقت الفعلي ، مثل الطي والتكشف وكذلك التمدد ، للبروتينات [84 & # x0201386] ، و RNAs [87] ، والمجمعات [41 ، 88]. يمكن استخدام هذه البيانات لاحقًا للتحقق من صحة و / أو صقل النماذج الفيزيائية والمحاكاة الجزيئية.

اقترحت الفهمات الخاصة بالآلية الانتقالية وكذلك آليات & # x022121 PRF أهدافًا جذابة للعلاجات المضادة للفيروسات. على الرغم من أنه من الممكن تطوير الأدوية التي تستهدف ريبوسوم حقيقيات النوى 80S وتغيير & # x022121 PRF [89 ، 90] ، فإن الآثار الجانبية غير واضحة ، بسبب الجينات الخلوية المحتملة التي تستخدم تغيير الإطارات ، ولكن لم يتم العثور عليها بعد [91 & # x0201393]. Developing drugs that specifically interact with viral 𢄡 PRF-stimulating structures could be a good intervention strategy. Indeed, small ligands have been identified to alter viral 𢄡 PRF efficiencies by binding to the 𢄡 PRF-promoting stem-loop in HIV-1 and the pseudoknot in severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) [6, 21, 27]. As described above, single-molecule force spectroscopy can provide the unfolding forces of various RNA structures, which correlate with 𢄡 PRF efficiencies much better than thermodynamic stabilities. Studies with various mutant 𢄡 PRF-promoting structures may facilitate drug discovery by identifying the essential residues and bondings responsible for their mechanical stabilities as well as interactions with the ribosome. Accordingly, combining the new biophysical tools sheds light on how future antiviral agents can be developed to work against the ubiquitous 𢄡 PRF mechanisms among viruses.


محتويات

Simplified schematics of the mechanisms of prokaryotic transcriptional termination. In Rho-independent termination, a terminating hairpin forms on the nascent mRNA interacting with the NusA protein to stimulate release of the transcript from the RNA polymerase complex (top). In Rho-dependent termination, the Rho protein binds at the upstream rut site, translocates down the mRNA, and interacts with the RNA polymerase complex to stimulate release of the transcript.

Two classes of transcription terminators, Rho-dependent and Rho-independent, have been identified throughout prokaryotic genomes. These widely distributed sequences are responsible for triggering the end of transcription upon normal completion of gene or operon transcription, mediating early termination of transcripts as a means of regulation such as that observed in transcriptional attenuation, and to ensure the termination of runaway transcriptional complexes that manage to escape earlier terminators by chance, which prevents unnecessary energy expenditure for the cell.

Rho-dependent terminators

Rho-dependent transcription terminators require a large protein called a Rho factor which exhibits RNA helicase activity to disrupt the mRNA-DNA-RNA polymerase transcriptional complex. Rho-dependent terminators are found in bacteria and phages. The Rho-dependent terminator occurs downstream of translational stop codons and consists of an unstructured, cytosine-rich sequence on the mRNA known as a Rho utilization site (rut) for which a consensus sequence has not been identified, and a downstream transcription stop point (ملعقة شاي). ال rut serves as a mRNA loading site and as an activator for Rho activation enables Rho to efficiently hydrolyze ATP and translocate down the mRNA while it maintains contact with the rut site. Rho is able to catch up with the RNA polymerase because it is being stalled at the downstream ملعقة شاي المواقع. Multiple different sequences can function as a tsp site. [1] Contact between Rho and the RNA polymerase complex stimulates dissociation of the transcriptional complex through a mechanism involving allosteric effects of Rho on RNA polymerase. [2] [3]

Rho-independent terminators

Intrinsic transcription terminators or Rho-independent terminators require the formation of a self-annealing hairpin structure on the elongating transcript, which results in the disruption of the mRNA-DNA-RNA polymerase ternary complex. The terminator sequence in DNA contains a 20 basepair GC-rich region of dyad symmetry followed by a short poly-A tract or "A stretch" which is transcribed to form the terminating hairpin and a 7𔃇 nucleotide "U tract" respectively. The mechanism of termination is hypothesized to occur through a combination of direct promotion of dissociation through allosteric effects of hairpin binding interactions with the RNA polymerase and "competitive kinetics". The hairpin formation causes RNA polymerase stalling and destabilization, leading to a greater likelihood that dissociation of the complex will occur at that location due to increased time spent paused at that site and reduced stability of the complex. [4] [5] Additionally, the elongation protein factor NusA interacts with the RNA polymerase and the hairpin structure to stimulate transcriptional termination. [6]


TRANSCRIPTION

The synthesis of messenger RNA from DNA is called transcription. The genetic information in DNA is not translated directly into proteins. These information are first transcribed into mRNA. Many enzymes are involved in the process of transcription. These enzymes perform following functions:

  • They unwind a region of a DNA molecule
  • They initiate and end mRNA synthesis.
  • They also modify the mRNA after the completion of transcription.

Only one or a few genes are exposed during transcription. Only one of the two DNA strands is transcribed. Eukaryotes have three enzymes involved in transcription of different RNAs. وهذه هي:

(أ) RNA Polymerase I is located in the nucleolus and transcribes ribosomal RNA (rRNA).

(ب) RNA Polymerase II is localized to the nucleus. It transcribes messenger RNA (mRNA) and most small nuclear RNAs

(c) RNA Polymerase III is localized to the nucleus. It transcribes transfer RNA (tRNA) and other small RNAs (including the small 5S rRNA).

There are following steps of transcription: I. Initiation

Following steps are involved in initiation of transcription:

(a) The site of DNA where DNA polymerase attaches is called

المروجين. Promoter is normally composed of 50 nucleotides. It is present at the start of gene. The promoter for polymerase II contains a TATA box. The TATA box binding protein (TBP) recognizes TATA boxes and attached the RNA polymerase on promoter.

(ب) في هذه المرحلة ، يكون الحمض النووي مزدوج الشريطة (& # 8220 مغلق & # 8221). This RNA Polymerase/wound-DNA structure is called closed complex.

(ج) The DNA is unwound and becomes single-stranded (“open”) near initiation site. This RNA •Polymerase/unwound-DNA structure is called the open complex.

(d) The RNA polymerase transcribes the DNA, but produces about 10 abortive nucleotides (transcripts). These are unable to leave the RNA polymerase because the exit channel is blocked by the

(e) The a-factor of RNA polymerase dissociates from the holoenzyme and elongation starts.

RNA polymerase starts joining complementary ribose nucleotides to the 3′ end of the DNA strand. The same complementary bases paired in DNA. But in RNA, the base uracil replaces the base’ thymine. Thus uracil complement to adenine.

Newly RNA transcripts uses adenosine-5’riphosphate (ATP), guanosine-5 1 -triphosphate (CUP) (purine nucleoside triphosphates). Uridine-5′-triphosphate (UTP) and cytidine-5 . -triphosphate (CTP) (pyrimidine nucleoside triphosphates).

2. Termination

Transcription continues. Finally, RNA polymerase reaches the termination sequences. Thus transcription stops. آليتان للإنهاء معروفتان جيدًا:

(a) Rho-independent termination: It involves the terminator sequences within the RNA that signal the RNA polymerase to

قف. The terminator sequence is usually a palindromic sequence. It forms a stem-loop hairpin structure. It dissociates the RNA polymeras from the DNA template. One such common termination palindromic sequence ‘GCCGCCAG’. The RNA polymerase fails to proceed beyond this point. Therefore, the nascent DNA-RNA hybrid dissociates.

(b) Rho-dependent termination: In this case termination factor called p factor(rho factor) stop RNA synthesis at specific sites. This protein binds and runs along the mRNA towards the RNA polymerase. When p-factor reaches the RNA polymerase, it dissociates RNA polymerase from the DNA, terminating transcription.

The newly transcribed mRNA is called the primary transcript. It is modified before leaving the nucleus. Some base sequences in newly transcribed mRNA do not code for proteins. RNA splicing cut out these noncoding regions. Thus-the mRNA coding region can he read continuously at the ribosome.

(أ)In Prokaryotes: The newly synthesized mRNA is directly

released into the cytoplasm in bacteria. It is converted into polypeptide chain in cytoplasm.

(ب) In eukaryotes: The mRNA in eukaryotes has to travel from inside the nucleus to ribosomes outside in the cytoplasm. Therefore, eukaryotic mRNA is modified in several ways. These modifications help it in its journey. A cap and a tail are added. Thus the molecule remains stable during long journey to ribosome. The caps and tails save the mRNA from the action of variety of nucleases and phosphatases enzymes.


7 The structure of the degradosome

The catalytic center for endonucleolytic activity in RNase E is exclusively located in the N-terminal half of the protein (see Figs. 4 and 6) [ 40, 41, 79]. In a study directed at understanding the domain structure of RNase E, Vanzo et al. [62] analyzed the role RNase E plays in the assembly of the بكتريا قولونية degradosome. The C-terminal half of RNase E contains distinct binding sites for the three degradosome components DEAD-box-helicase RhlB, enolase, and PNPase. Contact apparently is made on a one to one basis between RNase E and the ligand, while there is no direct interaction between the three. In particular, no interaction between PNPase α subunit and enolase was observed, making further questionable the fact that originally enolase was named β subunit of PNPase [61]. Vanzo et al. also showed direct evidence for oligomerization of RNase E, which was already proposed by Mackie [32]. The RhlB helicase is highly activated when in contact with the binding domain of RNase E. RNase E, apart from its own catalytic abilities, with its C-terminus is the assembly platform for the degradosome. A truncated C-terminal half of بكتريا قولونية RNase E can bind the degradosome components PNPase, RhlB, and enolase [80].

The prokaryotic degradosome. This scheme presents a model for the structural organization of the degradosome acting on 3′-ends. The various pools for phosphate in this micro-environment are أورثو-phosphate Pأنا, poly-phosphate (Pأنا)ن, mononucleotide diphosphates NDP, and ATP. The inhibitory or stimulatory influence of these pools on mRNA degradation is indicated by + or −. NDPs inhibit PNPase, poly-phosphate probably inhibits the helicase. The model reflects the current ideas about the interaction of known degradosome components. PPK, poly-phosphate kinase PNPase, polynucleotide kinase.

The prokaryotic degradosome. This scheme presents a model for the structural organization of the degradosome acting on 3′-ends. The various pools for phosphate in this micro-environment are أورثو-phosphate Pأنا, poly-phosphate (Pأنا)ن, mononucleotide diphosphates NDP, and ATP. The inhibitory or stimulatory influence of these pools on mRNA degradation is indicated by + or −. NDPs inhibit PNPase, poly-phosphate probably inhibits the helicase. The model reflects the current ideas about the interaction of known degradosome components. PPK, poly-phosphate kinase PNPase, polynucleotide kinase.

Our lab has recently purified the degradosome from R. capsulatus (Fuhrmann, Rauhut and Klug, unpublished results). An RNase E of the apparent ‘180’-kDa type, RhlB helicase, enolase, and PNPase are present in the complex and, most interestingly, a second DEAD-box RNA helicase of 65 kDa. This complex would therefore be able to operate in a similar mode as that proposed for بكتريا قولونية.

It is now time to look at the currently known RNases E to see whether all of them are fit to act as degradosome assemblers. A recent compilation of RNases E compares the enzymes from E. coli, Haemophilus influenzae, Synechocystis, Porphyria chloroplasts, and السل الفطري [80]. The enzymes from متزامن و Porphyria chloroplast only have a reported length of approximately 50% of the بكتريا قولونية و المستدمية النزلية البروتينات. The reported parts are clearly homologous with the N-terminus of the latter two. ال E. coli, H. influenzae، و ال مرض السل enzymes share the same length. The former two have highly homologous N-termini, their C-termini being highly divergent. مرض السل shows limited homology over the full length. The just published sequence of the Rickettsia prowazekii genome revealed the presence of an only 683 amino acid long RNase E. Only the N-terminal two thirds show the usual high sequence homology (with a 90-amino acid insert in the ultimate N-terminus). If the situation of dramatically shortened C-termini alone should already give cause to doubt a general presence of an RNase E-mediated degradosome, then the more so when we consider the fact that almost all of the completely sequenced bacterial genomes lack a detectable RNase E like protein. Evolution not only found different solutions for the C-terminus of RNase E, but also for the entire activity exemplified by RNase E. The 13.3-kDa protein ARD-1 from human cells is a functional analogue of بكتريا قولونية RNase E, shares structural features, and can rescue rne-deficient بكتريا قولونية strains [ 81, 82].

It is interesting, though, to look at degradosome-like complexes which have been described in cellular organelles like chloroplasts and mitochondria, both of bacterial origin. A chloroplast high molecular mass complex with PNPase and an RNase E-like enzyme was described [ 83, 84]. The RNase E-like activity has a molecular mass of 67 kDa and is recognized by بكتريا قولونية anti-RNase E antibodies. In yeast mitochondria the mtEXO complex contains three major proteins with 3′→5′ exonuclease activity and is involved in mtRNA degradation [85]. The complex shows NTP requirement for nuclease activity and NTPase activity, both indicative of the presence of a helicase. One component was recently identified as DExH-box RNA helicase [86]. The yeast nucleus contains a different type of high molecular mass complex, the exosome [87]. This complex of 300–400 kDa harbors five 3′→5′ exonucleases, mostly homologues of بكتريا قولونية 3′→5′ exonucleases, but no helicases. All nucleases are vital parts needed for precursor rRNA processing. Interacting with ATP-dependent RNA helicases like the yeast Dob1p and Ski2p, the exosome probably has an important role in the mRNA turnover of all eukaryotes [ 88–90]. أيضا بكتريا قولونية degradosome was shown recently to be involved in rRNA degradation in بكتريا قولونية [91].


Free ribosomes and bound ribosomes are interchangeable. The cell ca change the numbers depending on its metabolic needs. The ribosomes read and translate cod.

In the process of translation, mRNA, tRNA, and the ribosome all work together to create the protein. The ribosomes hold the mRNA and allows the tRNA to come .

Translation may occur in either the cytoplasm or the rough endoplasmic reticulum. Two molecular factors that play a key role in translation are transfer RNAs.

The enzyme RNA polymerase synthesis mRNA following the rules of compatible base pairing. For instance, DNA sequence A, T, G, C, G indicates the complementary.

The amino acid sequence was detached and compared. All parts were detached and returned to bag. Results In this lab, a DNA model was constructed and then the.

Having one or two strands makes a huge differences, because RNA has only one single strand, its quilt smaller than DNA, making RNA fit through the nucleus do.

A part of RNA that is produced by an enzyme binds to the end of the beginning strand. RNA (primer) is the starting point for DNA synthesis. RNA primase is us.

Transcription in prokaryotes requires the formation of the holoenzyme RNA polymerase (holoRNAP), which consists of a core enzyme and a σ subunit. The core en.

Retro transposons first transcribe themselves in RNA and then RNA is copied to DNA again by reverse transcriptase which is generally encoded by mobile elemen.

This discontinuous synthesis of DNA causes short segments of DNA called Okazaki fragments to be formed. As DNA polymerase continues to synthesis DNA, Topoiso.


شاهد الفيديو: طور إنهاء الانتساخ عند بدائيات النوى - تشكل بنية ملقط الشعر. وراثة طبية (يونيو 2022).


تعليقات:

  1. Rockwell

    في شيء ما أعتقد أيضًا ، ما هي الفكرة الجيدة.

  2. Tygorn

    الأشياء الجيدة تأتي في مجموعات صغيرة.

  3. Tet

    أنا هنا بالصدفة ، لكنني سجلت بشكل خاص في المنتدى للمشاركة في مناقشة هذه القضية.



اكتب رسالة