معلومة

مطياف الكتلة مقابل النشاف الغربي للتحقق من صحتها

مطياف الكتلة مقابل النشاف الغربي للتحقق من صحتها


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لدي بيانات قياس الطيف الكتلي (LC-MS / MS) من قشور الفئران تحت العلاجات الدوائية أو المراقبة. تم إجراء النتائج في ثلاث نسخ (ثلاثة أزواج من الجرذان ، المخدرات أو المجموعة الضابطة لكل زوج). بالإضافة إلى بعض تحليلات المعلوماتية الحيوية التي أقوم بها ، سيتعين علي التحقق من بعض التغييرات في الطيات من قياس الطيف الكتلي بواسطة لطخة ويسترن من أجل نشر نتائجي.

بعض البروتينات التي اخترتها للتحقق من صحة العمل بشكل جيد للغاية من خلال لطخة غربية تلتقط نفس الاتجاه مثل مقياس الطيف الكتلي. ومع ذلك ، فإن البروتينات الأخرى التي حاولت التحقق من صحتها تسير في الاتجاه المعاكس تمامًا.

أسئلتي:

  1. بشكل عام ، ما مدى دقة مطياف الكتلة مقارنة بالنشاف الغربي؟
  2. هل من غير المعتاد وجود الكثير من التباين بين نتائج الطريقتين؟ أشعر بالقلق من أنني قد أضطر إلى تجربة بروتينات متعددة قبل أن أرى النتائج مكررة ويبدو أن هذا يمثل مشكلة بالنسبة لي. هذا يقودني إلى السؤال الثالث.
  3. ما النتيجة التي يجب أن أثق بها؟

معلومات أخرى - تأتي بعض البروتينات التي اخترتها للتحقق من صحتها من أقل في القائمة حيث لم يتم اكتشاف العديد من شظايا الببتيد. في بعض الحالات ، تم الكشف عن شظايا في 2 فقط من 3 مكررات بيولوجية. لم أختر التحقق من صحة البروتينات حيث تباينت التكرارات 2 أو 3 على نطاق واسع في قيم العد الطيفي الطبيعي لذا أتوقع أن تكون هذه القراءات دقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء جزء قياس الطيف الكتلي من التجربة بواسطة مختبر حسن السمعة قام بتصفية البيانات الخاطئة باستخدام قطع FDR. هناك ارتباط كبير بشكل عام بين جميع التكرارات الثلاثة لعلاج معين وخطأ قياسي منخفض بين العينات عبر السكان ، لذلك ، من الناحية الإحصائية ، أثق في نتائج مواصفات الكتلة.

إذا كنت بحاجة إلى مزيد من المعلومات ، فيرجى طرحها - لا أعرف بالضبط ما سيكون مفيدًا للإجابة على أسئلتي.

تعديل :

تناقش هذه المقالة مبرر استخدام النشاف الغربي للتحقق من صحة نتائج المواصفات الجماعية. يقترح استخدام فحوصات مراقبة التفاعل المختارة كبديل. تم تكرار بعض النقاط التي أدلى بها المعلقون في هذا الموضوع في هذه المقالة.


إنها ممارسة شائعة لإثبات النتيجة باستخدام تقنية متعامدة. مثل RNAseq متبوعًا بـ qRT-PCR إلخ.

النشاف الغربي ليس أسلوبًا قويًا والمقارنات العرضية صعبة بسبب الاختلاف في الرغبة / الانجذاب للأجسام المضادة المختلفة. لذلك لا يمكن إجراء المقارنات إلا بزوج واحد من البروتين في ظروف مختلفة.

LC-MS أكثر حساسية وأقل تحيزًا (IMO). لذا فإن الحيلة العامة هي - لا تفعل الغرباء لجميع البروتينات فقط قم بالإبلاغ عن تلك التي تتصرف بشكل جيد (قل أنك "اخترت" هذه لأنها مهمة). أعلم أن هذه ممارسة خاطئة ولا ينبغي أن أدافع عنها. من أجل التحقق العلمي الخاص بك ، جربه باستخدام تقنية أخرى للتصلب المتعدد ؛ إذا كنت تستخدم ESI-Quadrupole / ion-Trap وما إلى ذلك ، فحاول استخدام MALDI-TOF أو iTRAQ. سيستمر بعض luddites في التشبث بالغرب.

أعتقد أنه من الأفضل عدم اختبار البروتينات التي تحتوي على عدد منخفض من الببتيد. انظر ما يعرف باسم مؤامرة MA. كثيرا ما يستخدم هذا للمصفوفات الدقيقة. هناميدل على أضعاف التغيير وأيدل على التعبير الكلي في كلتا العينتين. لا تختار بروتينات قليلة التعبير في كلتا العينتين ؛ قد لا تكون ذات مغزى. على سبيل المثال إذا كان لديك2جزيئاتXو100جزيئاتصفي حالة التحكم و5جزيئاتXو200جزيئاتصفي الاختبار ثم تتغير الطيةXقد يبدو مهمًا ؛ ومع ذلك ، قد لا يكون هذا التغيير مناسبًا ويمكن أن يكون نتيجة للتذبذب العشوائي / خطأ القياس. إذا كان لديك العديد من العينات ، يمكنك معرفة ما إذا كان هناك شيء عشوائي أم لا ولكن القيد هو عدد العينات.

ملحوظة: أنا لا أقول أن زيادة الجزيء 2 → 5 يجب أن تكون بلا معنى. ولكن لمعرفة ما إذا كان لها معنى أم لا ، ستحتاج إلى نماذج أكثر تعقيدًا ؛ من الأفضل تجنبها في هذه اللحظة.


علم البروتيوميات عن طريق قياس الطيف الكتلي: المناهج والتطورات والتطبيقات

مقياس الطيف الكتلي (MS) هو الأداة الأكثر شمولاً وتنوعاً في علم البروتينات واسعة النطاق. في هذه المراجعة ، قمنا بتقسيم الإطار العام لتجربة MS إلى مكوناتها الرئيسية. نناقش أساسيات التحليلات البروتينية بالإضافة إلى التطورات الأخيرة في مجالات طرق الفصل ، والأجهزة ، والتصميم التجريبي الشامل. نسلط الضوء على كل من نقاط القوة والقيود الكامنة في بروتين MS ونقدم دليلاً تقريبيًا لاختيار التصميم التجريبي بناءً على أهداف التحليل. نؤكد على تعدد استخدامات Orbitrap ، وهو محلل كتلة جديد يتميز بدقة عالية (تصل إلى 150000) ، ودقة كتلة عالية (2-5 جزء في المليون) ، ونطاق كتلة لشحن 6000 ، ونطاق ديناميكي أكبر من 10 ( 3). تعمل دقة الكتلة العالية لـ Orbitrap على توسيع ترسانة أساليب الحصول على البيانات وتحليلها مقارنة بأداة منخفضة الدقة. نناقش تقنيات الكروماتوغرافيا المختلفة ، بما في ذلك الفصل متعدد الأبعاد واللوني السائل فائق الأداء. تتضمن تقنية تحديد البروتين متعدد الأبعاد (MudPIT) إعداد عينة متصلة ، وفصل متعامد ، وحلول MS والبرمجيات. نناقش العديد من جوانب تطبيقات MudPIT على البروتينات الفسفورية الكمية. يتضمن تطبيق MudPIT للتحليل واسع النطاق للبروتينات الفوسفاتية (أ) إجراء تجزئة لإثراء الفوسفوببتيدات الخاص بالعنصر ، (ب) تطوير أدوات معلوماتية لاستجواب بيانات فوسفوببتيد البندقية والتحقق من صحتها ، و (ج) تحليل متعمق للبيانات من أجل التحديد المتزامن لتعبير البروتين ومستويات الفسفرة ، التناظرية لقياسات اللطخة الغربية. نوضح تطبيق MudPIT على البروتينات الفسفورية الكمية لمسار بيتا الأدرينالي. نناقش العديد من الاكتشافات البيولوجية التي تم إجراؤها عبر خطوط أنابيب قياس الطيف الكتلي مع التركيز على بروتينات إشارات الخلايا.


التحقق من صحة قياس بروتين كاربونيل: دراسة متعددة المراكز

يتم تحليل كربونيل البروتين على نطاق واسع كمقياس لأكسدة البروتين. توجد عدة طرق مختلفة لتحديدها. وصفت دراسة سابقة أوامر التباين في الحجم التي كانت موجودة عندما تم تحليل بروتينات الكربونيل في مختبر واحد بواسطة ELISA باستخدام مجموعات تجارية مختلفة. لقد استكشفنا أيضًا الأسباب المحتملة للتباين في تحليل الكربونيل في دراسة حلقية. تم تحضير جزء بروتين قابل للذوبان من كبد الفئران وتعريضه للإشعاع فوق البنفسجي 0 و 5 و 15 دقيقة. تم توزيع المستحضرات المجففة بالتبريد على ستة مختبرات مختلفة تقوم بشكل روتيني بتحليل البروتين الكربوني في جميع أنحاء أوروبا. كشفت تقنيات ELISA والنشاف الغربي عن زيادة في تكوين بروتين الكربونيل بين 0 و 5 دقائق من الإشعاع فوق البنفسجي بغض النظر عن الطريقة المستخدمة. بعد التشعيع لمدة 15 دقيقة ، تم الكشف عن أكسدة أقل من قبل نصف المختبرات مقارنة بالتشعيع لمدة 5 دقائق. سقطت ثلاثة من نتائج الكربونيل اليزا الأربعة ضمن فواصل ثقة 95٪. قد تُعزى الأخطاء المحتملة في حساب قيم الكربونيل المطلقة إلى الاختلافات في التقييس. من بين ما يصل إلى 88 بروتينًا تم تحديدها على أنها تحتوي على مجموعات الكربونيل بعد الانقسام التجريبي لبروتينات الكبد المشععة والسيطرة ، كانت سبعة فقط شائعة في جميع مستحضرات الكبد الثلاثة. من المحتمل أن تكون بقايا اللايسين والأرجينين المعدلة بواسطة الكاربونيل مقاومة لتحلل البروتينات التجريبي. قد يؤدي استخدام مزيج من البروتياز إلى زيادة تعافي الببتيدات المؤكسدة. في الختام ، يعد التوحيد أمرًا بالغ الأهمية لتحليل الكربونيل وقد لا يتم تحليل البروتينات شديدة التأكسد بشكل فعال بأي تقنية موجودة.

الكلمات الدالة: مسبار رد الفعل Aldehyde Carbonyl ELISA مطياف الكتلة البروتين المؤكسد اللطخة الغربية أكسدة البروتين.

حقوق النشر © 2015. تم النشر بواسطة Elsevier B.V.

الأرقام

كاربونيل البروتين الأولي والثانوي ...

كاربونيل البروتين الأولي والثانوي واشتقاقها بواسطة DNPH.

حساب تقدير كمية الكربونيل بواسطة ...

حساب الكميات الكربونية عن طريق تحليل DNP adducts.

كاربونيل بروتين الكبد شبه الكمي القابل للذوبان ...

محتوى كاربونيل بروتين الكبد شبه الكمي القابل للذوبان بعد 0-15 دقيقة من الأشعة فوق البنفسجية. (أ) كوماسي ...

تحديد كمية بروتين كاربونيل ...

الكمي للبروتينات الكربونية في مستخلص كبد الجرذان البروتين القابل للذوبان. تحليل قياس الكثافة ...

كربونيل البروتين في كبد الفئران ...

البروتين الكربوني في جزء البروتين القابل للذوبان في كبد الفئران بعد زيادة التشعيع بواسطة ...


خيارات الوصول

احصل على الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو وصول كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


طرق جديدة للتحقق من صحة الجسم المضاد باستخدام الترسيب المناعي وقياس الطيف الكتلي

تُستخدم الأجسام المضادة في مجموعة واسعة من تطبيقات البحث والتشخيص لإثراء البروتينات وكشفها وتقديرها وتعديلاتها. مئات الآلاف من الأجسام المضادة متاحة تجارياً ضد آلاف البروتينات وتعديلاتها. لسوء الحظ ، فإن العديد من الأجسام المضادة تتميز بسمات سيئة ، مما يؤدي إلى إهدار الوقت والتكلفة بالإضافة إلى استنتاجات بحثية معيبة. للتحقق من أداء وخصوصية الأجسام المضادة لـ Thermo Scientific ، أنشأنا سير عمل شاملًا لتقييم خصوصية الأجسام المضادة باستخدام الترسيب المناعي جنبًا إلى جنب مع قياس الطيف الكتلي (IP-MS). في التجارب الأولية ، قمنا بفحص أكثر من 500 من الأجسام المضادة لما يقرب من 100 بروتين رئيسي للإشارات السرطانية يتم التعبير عنها عبر 12 خطًا من الخلايا السرطانية المزروعة. يمكن استخدام ما يقرب من 70٪ من الأجسام المضادة التي تم التحقق من صحتها مسبقًا من أجل الالتقاط المناعي لالتقاط وتحديد الهدف المقصود ، وتفاعل البروتينات ، والأهداف البعيدة ، و

40٪ من الأجسام المضادة التي لم يتم التحقق من صحتها مسبقًا لـ IP كانت إيجابية بواسطة IP-MS. لإثبات فعالية هذه الأجسام المضادة ، استخدمنا مجموعة من هذه الأجسام المضادة لالتقاط اثني عشر بروتينًا في وقت واحد في مسار Akt / mTOR ، ثم حددنا كمية البروتينات وتفسفرها في أربعة خطوط خلوية محفزة بـ IGF باستخدام القياس الكمي المستهدف المستند إلى MS. أظهرت المقارنة المعيارية لمقايسات IP-MS متعددة الإرسال هذه ارتباطًا معتدلًا بالتقدير الكمي مع فحوصات النشاف الغربية التقليدية و ELISA و Luminex.


الملخص

يتم تحليل كربونيل البروتين على نطاق واسع كمقياس لأكسدة البروتين. توجد عدة طرق مختلفة لتحديدها. وصفت دراسة سابقة أوامر التباين في الحجم التي كانت موجودة عندما تم تحليل بروتينات الكربونيل في مختبر واحد بواسطة ELISA باستخدام مجموعات تجارية مختلفة. لقد استكشفنا أيضًا الأسباب المحتملة للتباين في تحليل الكربونيل في دراسة حلقية. تم تحضير جزء بروتين قابل للذوبان من كبد الفئران وتعريضه للإشعاع فوق البنفسجي 0 و 5 و 15 دقيقة. تم توزيع المستحضرات المجففة بالتبريد على ستة مختبرات مختلفة تقوم بشكل روتيني بتحليل البروتين الكربوني في جميع أنحاء أوروبا. كشفت تقنيات ELISA والنشاف الغربي عن زيادة في تكوين بروتين الكربونيل بين 0 و 5 دقائق من الإشعاع فوق البنفسجي بغض النظر عن الطريقة المستخدمة. بعد التشعيع لمدة 15 دقيقة ، تم الكشف عن أكسدة أقل بنصف المختبرات مقارنة بالتشعيع لمدة 5 دقائق. سقطت ثلاثة من نتائج الكربونيل اليزا الأربعة ضمن فواصل ثقة 95٪. قد تُعزى الأخطاء المحتملة في حساب قيم الكربونيل المطلقة إلى الاختلافات في التقييس. من بين ما يصل إلى 88 بروتينًا تم تحديدها على أنها تحتوي على مجموعات الكربونيل بعد الانقسام التجريبي لبروتينات الكبد المشععة والسيطرة ، كانت سبعة فقط شائعة في جميع مستحضرات الكبد الثلاثة. من المحتمل أن تكون بقايا اللايسين والأرجينين المعدلة بواسطة الكاربونيل مقاومة لتحلل البروتينات التجريبي. قد يؤدي استخدام مزيج من البروتياز إلى زيادة تعافي الببتيدات المؤكسدة. في الختام ، يعد التوحيد أمرًا بالغ الأهمية لتحليل الكربونيل وقد لا يتم تحليل البروتينات شديدة التأكسد بشكل فعال بأي تقنية موجودة.


مقدمة

تتضمن معظم العمليات البيولوجية عمل وتنظيم المجمعات متعددة البروتينات. في كثير من الحالات ، يتم تحديد الخصائص المنفصلة مثل التوطين تحت الخلوي ، والنشاط التحفيزي ، وخصوصية الركيزة بواسطة عديد ببتيدات مختلفة في مركب هولو أنزيم ، وقد يتواجد شركاء تفاعل بروتين معين بكميات غير متجانسة. على سبيل المثال ، يمكن للوحدات الفرعية التحفيزية مثل بروتين فوسفاتيز 1 (PP1) أن تتفاعل مع مجموعة من شركاء البروتين البديل ، والتي ترتبط بالتالي بطريقة غير متجانسة لتوليد مجموعة من الإنزيمات المجسمة ذات الخصائص المختلفة (للمراجعة ، انظر Moorhead et al. ، 2007). هذا يمكن أن يجعل من الصعب التمييز بين البروتينات المتفاعلة المحددة ولكن ذات الوفرة المنخفضة والعدد الأكبر من البروتينات الملوثة المنخفضة ، ولكنها وفيرة ، والتي يتم استعادتها حتمًا باستخدام طرق شائعة الاستخدام مثل استراتيجيات السحب أو الترسيب المناعي. لذلك ، فإن الهدف الرئيسي في معظم مجالات بيولوجيا الخلية هو توصيف مكونات البروتين في المجمعات متعددة البروتينات من خلال التحديد الموثوق به لشركاء تفاعل البروتين المحدد.

يجب التحقق من صحة أي شريك تفاعل مفترض تم تحديده إما من خلال تنقية التقارب أو التجزئة البيوكيميائية لتأكيد أهميته الفسيولوجية. إن تجارب التحقق من صحة المصب ، التي تتضمن توصيفًا جزيئيًا مفصلاً ، مكلفة وتستغرق وقتًا طويلاً ، وبالتالي من الضروري تركيز الموارد على تلك المجموعات الفرعية للتفاعلات المحتملة مع احتمال كبير للأهمية البيولوجية. التحسين المستمر في حساسية ودقة تقنية قياس الطيف الكتلي لتحديد البروتين ، على سبيل المثال ، يسمح بتحديد أعداد أكبر من البروتينات في تجارب الانجذاب المناعي والمنسدل. بالإضافة إلى شركاء التفاعل الحقيقيين ، تشمل هذه القوائم الموسعة أعدادًا متزايدة من البروتينات الملوثة ، بما في ذلك تلك التي ترتبط بشكل غير محدد بمصفوفة التقارب. لا يمكن التغلب على مشكلة الارتباط غير المحدد بشكل مُرضٍ باستخدام طرق تنقية عالية الصرامة على الرغم من أن هذا يمكن أن يقلل من مستوى الارتباط غير المحدد ، إلا أنه سيؤدي حتماً إلى إزالة البروتينات الشريكة منخفضة الوفرة وانخفاض التقارب المحدد. لذلك يجب أن تحافظ الإستراتيجية الأكثر فاعلية على جميع أحداث التفاعل المحددة ، والتي تؤدي حتماً إلى عدد كبير من البروتينات غير المحددة التي تعمل أيضًا على التوحيد والتي يجب تحديدها والتخلص منها.

لحل هذه المشكلة ، أثبتنا نحن وآخرون أن النهج القائم على قياس الطيف الكتلي الكمي جنبًا إلى جنب مع وسم النظائر يمكن أن يساعد في التمييز بين البروتينات العديدة المحددة في تجربة المنسدلة أو الترسيب المناعي التي تمثل ارتباطًا محددًا. يتم ذلك من خلال تضمين عنصر تحكم سلبي ، والذي يوفر خلفية للبروتينات الملوثة التي ترتبط بشكل غير محدد بمصفوفة التقارب و / أو علامة الاندماج ، والتي تبرز بوضوح البروتينات التي ترتبط على وجه التحديد بالبروتين محل الاهتمام (للمراجعة ، انظر فيرميولين وآخرون ، 2008). على سبيل المثال ، باستخدام مزيج من وضع العلامات على النظائر المستقرة مع الأحماض الأمينية في ثقافة الخلية (SILAC) - البروتينات الكمية المستندة إلى (Ong et al. ، 2002) مع الترسيب المناعي لبروتينات الاندماج الموسومة بـ GFP ، كشفنا عن اختلافات في شركاء الارتباط لاثنين من الأشكال الإسوية المختلفة من فوسفاتيز البروتين النووي ، PP1 (Trinkle-Mulcahy et al. ، 2006). استخدمت مجموعات أخرى نهجًا مشابهًا يعتمد على بروتينات الطعم الموسومة لرسم خريطة طيف البروتينات المتفاعلة للبروتينات البشرية 26S (Wang and Huang ، 2008) وللكشف عن الأعضاء الديناميكية لمجمعات عامل النسخ (Mousson et al. ، 2008). كما تم استخدام المناهج الكمية القائمة على النظائر لتحديد مجمعات البروتين الموسومة في الخميرة (Ranish et al. ، 2003 Tackett et al. ، 2005) ومجمعات البروتين الموسومة والداخلية في خلايا الثدييات (Blagoev et al. ، 2003 Cristea et al. ، 2005 Selbach and Mann ، 2006).

على الرغم من أن استراتيجية وضع العلامات على النظائر المستخدمة في نهج تنقية التقارب SILAC توفر مساعدة كبيرة في فصل المتفاعلات المحددة عن المتفاعلات غير المحددة ، تظهر التجربة أنه لا يمكن تحديد جميع التفاعلات المحددة بشكل لا لبس فيه ، لا سيما بالقرب من مستوى العتبة حيث تكون نسب الإشارة إلى الضوضاء قريبة من الخلفية . نحن هنا نصف إستراتيجية قياس طيف الكتلة جديدة قائمة على SILAC والتي تعالج هذه المشكلة على وجه التحديد ، وتتضمن طرقًا لزيادة الإشارة ، أي وفرة مجمعات البروتين المنقى ، مع تقليل الضوضاء أو ترشيحها ، أي البروتينات التي ترتبط بشكل غير محدد بالتقارب المصفوفة و / أو العلامة و / أو الجسم المضاد.

تعتمد كفاءة اكتشاف شركاء التفاعل على الاستنزاف الفعال للمجمع المستهدف. نوضح هنا أن البروتينات التي تحمل علامات GFP يمكن أن تكون قريبة من النضوب الكمي باستخدام رابط GFP الذي تم تطويره مؤخرًا (Rothbauer et al. ، 2008). الموثق GFP هو ملف الإشريكية القولونية–يعبر عن بروتين 16 كيلو دالتون مشتق من جسم مضاد لاما ثقيل السلسلة يرتبط بدرجة عالية من الألفة والنوعية بـ GFP. هذا يؤكد فائدة استخدام GFP كعلامة مزدوجة لتنقية التقارب والفحص المجهري في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، فإن توصيف البروتينات التي ترتبط بشكل غير محدد بثلاثة من أكثر مصفوفات التقارب شيوعًا ، سواء في المستخلصات الخلوية الكاملة ، أو النووية ، أو السيتوبلازمية لخلايا الثدييات ، يوفر مرشح "بروتين حبة". هذا يسهل التمييز بين بروتينات الربط المحددة وغير المحددة ، وبالتالي يسمح بتحديد الأولويات الموضوعية للأهداف المناسبة للتوصيف الجزيئي المفصل.

باختصار ، نقدم هنا سير عمل قويًا وموثوقًا يمكن تطبيقه لتحليل مجمعات البروتين المنقى بتقارب المعزولة باستخدام إما بروتينات الاندماج الموسومة أو عن طريق الترسيب المناعي للبروتينات الذاتية.


المواد والأساليب

المواد البيولوجية

في هذه الدراسة ، مكتبات (كدنا) ، ناقلات التعبير pET-30a (Novagen) و pET30a-GST ، نسخة تحتوي على علامة الجلوتاثيون S-transferase (GST) من pET30a ، تم إنشاؤها في مختبرنا (Cao) وآخرون.، 2010) ، والسلالات البكتيرية (DH5α ، BL21 ، و ER2566). أنزيمات التقييد بامأهلا، زهوأنا، سابقة بمعنى البيئةRI ، هينتم شراء dIII و T4 DNA ligase و Ex Taq DNA polymerase من TAKARA.

عينات الأرز

تم جمع أربعة أنواع من عينات الأرز واستخدامها لتحليل النشاف الغربي في هذه الدراسة: (1) 10 عينات من الشتلات (النبتة والجذر) ، والحراثة (الأوراق والساق) ، والتأصيل (ورقة العلم والعناق الصغيرة) ، والزهرة (العلم) الأوراق والعنب) ، ومراحل التعبئة (ورقة العلم والبذور) من صنف الأرز 93-11 (أرز أسيوي (2) سبع عينات أوراق تم جمعها على فترات 4 ساعات بدءًا من الساعة 12 ظهرًا خلال يوم واحد. Xa21 (شيانغ وآخرون.، 2006) ، الملقح مع العرق الفلبيني غير المتوافق 6 من Xanthomonas oryzae الكهروضوئية. اوريزي (Xoo) في 0 و 1 و 2 و 4 و 8 ساعات و 1 و 3 و 5 د و (4) أربع عينات من القمح والذرة والقطن و A. thaliana يترك خلال فترة النمو. تم تجميد جميع المواد باستخدام النيتروجين السائل وتخزينها في -70 درجة مئوية حتى الاستخدام.

تنبؤ الببتيد المستضد وتصميم التمهيدي

تم استخدام برنامج BEPITOPE (Odorico and Pellequer ، 2003) للتنبؤ بشظايا المستضدات التي تم اختيار تلك الأجزاء الفريدة في جينوم الأرز ، بمجرد التحقق منها بواسطة BLASTP ، كمستضد لتوليد أجسام مضادة محددة ضد البروتينات المستهدفة. برنامج PrimerCE (Cao وآخرون.، 2010) لتصميم البادئات بناءً على تسلسل الترميز (CDS) الذي تم تنزيله من قاعدة بيانات TIGR (http://rice.plantbiology.msu.edu/) كما هو موضح أدناه. الأحرف التي تحتها خط هي مواقع التعرف على إنزيم التقييد. يتم سرد المواضع التفصيلية في تسلسل cDNA كامل الطول والببتيد في الجدول 1. Os09g30418.1F ، 5′-CG GGATCC TTCGCCTTCCAGGCCGAGAT-3 ′ Os09g30418.1R ، 5′-CCG CTCGAG CTCCTCAAGGTATTCCAGCTGA-5 10 0.1 -G GAATTC CTTGGCGCTCGTCTTACGGAGG-3 ′ Os05g04510.1R ، 5′-CCC AAGCTT GCCACTAGCAACAATGCTTGG-3 ′ Os06g46770.2F ، 5′-GATTC ATGCAGATCTTAGTGTGAAGACCC-3 CCTAGTGTGAAGACCC6 3 CCTAGTGTGAAGACCC6 3 CCTAGTGTGAAGACCC6 3 5′-G GAATTC AAGAACGTTGCGGTGAAGG-3 ′ Os03g08020.1R ، 5′-CCC AAGCTT TCATTTCTTCTTGGCGGCAG-3 ′ Os03g50890.1F ، 5′-G GAATTC ACCATTAGGT OsGCTGTC03GT.

الأرز المرشح للبروتين المرجعي

اسم الجين رقم المكان حاشية. ملاحظة مول. الوزن (كيلو دالتون) مولد المضاد طول القطعة (الموضع) / تسلسل الببتيد
HSP Os09g30418.1 بروتين الصدمة الحرارية 94 معبر عن البروتين 182 حمض أميني (8-189)
UBQ Os06g46770.2 بوليوبيكويتين يحتوي على 7 مونومرات يوبيكويتين 60 معبر عن البروتين 150 حمض أميني (1-150)
حوض Os01g59150.1 سلسلة توبولين بيتا 4 50 الببتيد المركب QYQDATADEEGEYEDEEQQ
eEF-1α Os03g08020.1 عامل الاستطالة 1-α 49 معبر عن البروتين 148AA (301–448)
eIF-4α Os02g05330.1 عامل بدء حقيقيات النوى 4-α 47 الببتيد المركب DAKHYDSKMQELLHQGDNEE
SAMS Os05g04510.1 س- إنزيم الأدينوسيل ميثيونين 1 43 معبر عن البروتين 150 حمض أميني (151-300)
يمثل Os03g50890.1 أكتين -1 42 معبر عن البروتين 128 حمض أميني (251–378)
جابده Os04g40950.1 جليسيرالديهيد -3 فوسفات ديهيدروجينيز ، عصاري خلوي 37 الببتيد المركب DLVSTDFQGDNRSSIFDAKAGI
UBC Os02g42314.2 إنزيم يوبيكويتين المترافق E2 18 الببتيد المركب PDSPLNCDSGNLLRSGDIRGY
اسم الجين رقم المكان حاشية. ملاحظة مول. الوزن (كيلو دالتون) مولد المضاد طول القطعة (الموضع) / تسلسل الببتيد
HSP Os09g30418.1 بروتين الصدمة الحرارية 94 معبر عن البروتين 182 حمض أميني (8-189)
UBQ Os06g46770.2 بوليوبيكويتين يحتوي على 7 مونومرات يوبيكويتين 60 معبر عن البروتين 150 حمض أميني (1-150)
حوض Os01g59150.1 سلسلة توبولين بيتا 4 50 الببتيد المركب QYQDATADEEGEYEDEEQQ
eEF-1α Os03g08020.1 عامل الاستطالة 1-α 49 معبر عن البروتين 148AA (301–448)
eIF-4α Os02g05330.1 عامل بدء حقيقيات النوى 4-α 47 الببتيد المركب DAKHYDSKMQELLHQGDNEE
SAMS Os05g04510.1 س- إنزيم الأدينوسيل ميثيونين 1 43 معبر عن البروتين 150 حمض أميني (151-300)
يمثل Os03g50890.1 أكتين -1 42 معبر عن البروتين 128 حمض أميني (251–378)
جابده Os04g40950.1 جليسيرالديهيد -3 فوسفات ديهيدروجينيز ، عصاري خلوي 37 الببتيد المركب DLVSTDFQGDNRSSIFDAKAGI
UBC Os02g42314.2 إنزيم يوبيكويتين المترافق E2 18 الببتيد المركب PDSPLNCDSGNLLRSGDIRGY

الأرز المرشح للبروتين المرجعي

اسم الجين رقم المكان حاشية. ملاحظة مول. الوزن (كيلو دالتون) مولد المضاد طول القطعة (الموضع) / تسلسل الببتيد
HSP Os09g30418.1 بروتين الصدمة الحرارية 94 معبر عن البروتين 182 حمض أميني (8-189)
UBQ Os06g46770.2 بوليوبيكويتين يحتوي على 7 مونومرات يوبيكويتين 60 معبر عن البروتين 150 حمض أميني (1-150)
حوض Os01g59150.1 سلسلة توبولين بيتا 4 50 الببتيد المركب QYQDATADEEGEYEDEEQQ
eEF-1α Os03g08020.1 عامل الاستطالة 1-α 49 معبر عن البروتين 148AA (301–448)
eIF-4α Os02g05330.1 عامل بدء حقيقيات النوى 4-α 47 الببتيد المركب DAKHYDSKMQELLHQGDNEE
SAMS Os05g04510.1 س-أدينوسيل ميثيونين سينثيتيز 1 43 معبر عن البروتين 150 حمض أميني (151-300)
يمثل Os03g50890.1 أكتين -1 42 معبر عن البروتين 128 حمض أميني (251–378)
جابده Os04g40950.1 جليسيرالديهيد -3 فوسفات ديهيدروجينيز ، عصاري خلوي 37 الببتيد المركب DLVSTDFQGDNRSSIFDAKAGI
UBC Os02g42314.2 إنزيم يوبيكويتين المترافق E2 18 الببتيد المركب PDSPLNCDSGNLLRSGDIRGY
اسم الجين رقم المكان حاشية. ملاحظة مول. الوزن (كيلو دالتون) مولد المضاد طول القطعة (الموضع) / تسلسل الببتيد
HSP Os09g30418.1 بروتين الصدمة الحرارية 94 معبر عن البروتين 182 حمض أميني (8-189)
UBQ Os06g46770.2 بوليوبيكويتين يحتوي على 7 مونومرات يوبيكويتين 60 معبر عن البروتين 150 حمض أميني (1-150)
حوض Os01g59150.1 سلسلة توبولين بيتا 4 50 الببتيد المركب QYQDATADEEGEYEDEEQQ
eEF-1α Os03g08020.1 عامل الاستطالة 1-α 49 معبر عن البروتين 148AA (301–448)
eIF-4α Os02g05330.1 عامل بدء حقيقيات النوى 4-α 47 الببتيد المركب DAKHYDSKMQELLHQGDNEE
SAMS Os05g04510.1 س- إنزيم الأدينوسيل ميثيونين 1 43 معبر عن البروتين 150 حمض أميني (151-300)
يمثل Os03g50890.1 أكتين -1 42 معبر عن البروتين 128 حمض أميني (251–378)
جابده Os04g40950.1 جليسيرالديهيد -3 فوسفات ديهيدروجينيز ، عصاري خلوي 37 الببتيد المركب DLVSTDFQGDNRSSIFDAKAGI
UBC Os02g42314.2 إنزيم يوبيكويتين المترافق E2 18 الببتيد المركب PDSPLNCDSGNLLRSGDIRGY

استنساخ الجينات وتعبير البروتين وتنقية البروتين

تم إجراء PCR باستخدام البلازميدات من مكتبات الأرز (كدنا) كقوالب. تم استخدام إنزيمات التقييد المشار إليها لهضم الأمبليكون والناقلات ، والتي تم تنقيتها بعد ذلك بالهلام. بعد ذلك ، تم تحويل المنتجات المرتبطة إلى بكتريا قولونية تم التحقق من DH5α ، والمواد المؤتلفة باستخدام تحليل التسلسل (معهد جينومكس بكين ، بكين ، الصين). تم تحويل المؤتلفات إلى بكتريا قولونية سلالة التعبير ER2566 أو BL21 ، والمثقف طوال الليل في وسط LB المضاف إليه كاناميسين (50 ميكروغرام مل -1) عند 37 درجة مئوية. تم تخفيف الثقافات بنسبة 1: 100 باستخدام وسط Luria-Bertani الطازج (وسط LB) المضاف إليه كاناميسين (50 ميكروغرام مل -1) و 1 ٪ جلوكوز ، وتم تربيتها عند 37 درجة مئوية إلى OD600 0.6-0.8. بعد ذلك ، تمت إضافة isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG 0.4 ميكرومتر) لمدة 3 ساعات للحث على التعبير عن بروتينات الاندماج. تم حصاد الخلايا البكتيرية وتمزقها باستخدام الصوتنة وتنقيتها بواسطة كروماتوجرافيا عمود النيكل. ثم تم فصل البروتينات المستهدفة باستخدام SDS – PAGE وصبغها باللون الأزرق Coomassie.

جيل الأجسام المضادة

تم إنتاج الأجسام المضادة متعددة النسيلة عن طريق تحصين الأرانب السليمة باستخدام بروتينات الاندماج المنقى أو الببتيدات المركبة كمستضدات. تم إجراء عمليات اقتران البروتين والتحصين وتنقية المصل بواسطة BPI (شركة Beijing Protein Innovation Co. ، Ltd ، بكين ، الصين).

استخلاص بروتينات الأرز وتحديد تركيزها

تم طحن أنسجة الأرز إلى مسحوق ناعم في نيتروجين سائل. قسامة 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج [62.5 ملي مولار من TRIS-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، 10٪ جلسرين ، 0.1٪ SDS ، 2 ملي مول EDTA ، 1 ملي فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) ، 5٪ (v / v) β-mercaptoethanol] كان يضاف إلى كل عينة مسحوق 300mg. تم تقليب الخليط ثم تبريده على الجليد لمدة 10 دقائق. تم طرد العينات عند 12000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتم جمع المادة الطافية وتخزينها عند -70 درجة مئوية. تم تحديد تركيزات البروتين في عينات الأرز باستخدام طريقة برادفورد (برادفورد ، 1976). تم تحميل كمية متساوية من بروتين الأرز وفصلها بواسطة SDS-PAGE ثم تلطيخها باللون الأزرق Coomassie.

النشاف الغربي والتحليل الكمي للإشارة

تم فصل كميات متساوية من بروتين الأرز من الأنسجة / الأعضاء المختلفة باستخدام SDS-PAGE ونقلها كهربائيًا إلى غشاء PVDF (Millipore Corporation ، Bedford ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) عند 100 فولت لمدة 60 دقيقة. تم غمر الغشاء في 5٪ حليب خالي من الدسم في محلول TTBS [0.2 M TRIS-HCl (pH 7.6) ، 1.37 M NaCl ، 0.1٪ Tween-20] لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. تم تحضين البروتينات مع الأجسام المضادة متعددة النسيلة في 5٪ حليب خالي من الدسم في محلول TTBS لمدة 3 ساعات عند درجة حرارة الغرفة وتعريضها لشطف لمدة 5 دقائق في محلول TTBS. تم تحضين الغشاء بعد ذلك بجسم مضاد للأرنب مترافق مع بيروكسيداز الفجل (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology Co. ، Ltd ، بكين ، الصين) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، وتعرض لثلاث مرات شطف لمدة 5 دقائق في محلول TTBS. تم تطوير اللطخة باستخدام مجموعة SuperECL Plus (Applygen ، بكين ، الصين) ، وتم تعريض الإشارة بفيلم الأشعة السينية.

تم مسح الصور ضوئيًا والتقاط شدة كل نطاق باستخدام ImageMaster 2D Platinum الإصدار 5.0 (GE Healthcare Amersham Bioscience). تم توحيد شدة كل نطاق كنسبة مئوية من الكثافة الكلية وتمت الإشارة إلى النتائج على أنها حجم نسبي يمثل وفرة التعبير النسبي للجين في العينات المختبرة. تم استخدام وفرة التعبير النسبي لتقييم استقرار التعبير البروتيني. تم إجراء النشاف الغربي والتحليل الكمي في ثلاثة مكررات بيولوجية على الأقل.

تحليل استقرار التعبير البروتيني

تم تقييم استقرار تعبير البروتين بواسطة geNorm v.3.5 (//medgen.ugent.be/∼jvdesomp/genorm/) (Vandesompele وآخرون.، 2002) وبرنامج Microcal Origin 6.0 (برنامج Microcal ، نورثامبتون ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استيراد قيم تعبير البروتين النسبية إلى geNorm ، والذي يحسب استقرار التعبير الجيني [قيمة M أو متوسط ​​التباين المعياري لجين مرشح معين بالنسبة إلى جميع الجينات الأخرى في مجموعة العينات المحددة (Murthi وآخرون.، 2008 سيلفيرا وآخرون.، 2009)] لتصنيف البروتينات في عينات الأنسجة المختلفة. كلما انخفضت قيمة M ، كان تعبير البروتين أكثر استقرارًا. بالإضافة إلى ذلك ، تم استيراد القيم النسبية لتعبير البروتين إلى Microcal Origin 6.0 ، والذي ينشئ مخططًا مربعًا لتقدير ثبات التعبير للبروتينات المرجعية المحتملة.

توليد منحنيات النشاف الغربية المعيارية وتحديد تركيز البروتينات المرجعية في الأرز

تم رسم تركيز البروتينات المؤتلفة مقابل إشارة النشاف الغربية الناتجة عن الأجسام المضادة المقابلة من أجل تقدير النطاق الخطي للكشف والحدود الدنيا لاكتشاف البروتينات المؤتلفة. بعد ذلك ، تم اختبار سلسلة من البروتينات المؤتلفة المخففة وبروتينات الأرز الكلية في نفس غشاء النشاف الغربي لتوليد المنحنى القياسي. تم استخدام المنحنى القياسي لحساب تركيز البروتين والنسبة المئوية للبروتينات المرجعية في الأرز. تم أيضًا تحليل سلسلة من التخفيفات من إجمالي بروتينات الأرز باستخدام النشاف الغربي من أجل تحديد الحدود الدنيا للكشف عن البروتينات المرجعية للأرز.

تحليل نسخي للجينات المرجعية للأرز

تم تنزيل بيانات نسخية عن أوراق الأرز والجذر والساق والذنب والبذور من MPSS (http://mpss.udel.edu/rice/) (ناكانو وآخرون.، 2006) وقواعد بيانات EST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/dbEST/) (Boguski وآخرون.، 1993). تم تقسيم مستوى النسخ إلى أربع درجات بناءً على شدة إشارة التعبير لمقارنتها بنتائج النشاف الغربي.


أساس اللطخة الغربية

هناك العديد من تقنيات "لطخة" في البيولوجيا الجزيئية مثل اللطخة الجنوبية ، اللطخة الشمالية ، اللطخة الشرقية ، اللطخة الغربية. مبدأ وعملية تقنيات لطخة متشابهة. اللطخة الجنوبية والشمالية هي تقنيات نشاف الحمض النووي ، منها اللطخة الجنوبية للكشف عن تسلسل محدد للحمض النووي في عينات الحمض النووي ، أما اللطخة الشمالية فهي دراسة التعبير الجيني عن طريق اكتشاف الحمض النووي الريبي (أو الرنا المعزول) في العينة. تُستخدم البقعة الشرقية لتحليل تعديلات ما بعد الترجمة (PTM) للبروتينات مثل الدهون ، وأصناف الفوسفوم ، والجليكوكونيجات.

تختلف عن تقنية اللطخة الموصوفة أعلاه ، فإن اللطخة الغربية ، والتي تسمى أيضًا اللطخة المناعية البروتينية ، هي تقنية تحليلية تستخدم لاكتشاف بروتينات معينة في عينة معينة مثل محللات الخلية أو تجانس الأنسجة أو المستخلص. يستخدم على نطاق واسع في علم الأحياء الجزيئي. قواعد تعريف اللطخة الغربية هما خاصيتان مميزتان: الوزن الجزيئي وخصوصية ربط الجسم المضاد. يستخدم الفصل الكهربائي للهلام (عادةً SDS-PAGE) لفصل البروتينات الأصلية عن طريق بنية ثلاثية الأبعاد أو البروتينات المشوهة بطول البولي ببتيد. ثم يتم نقل عينة البروتين إلى غشاء (عادة النيتروسليلوز أو PVDF) ، حيث يتم فحصها باستخدام الأجسام المضادة المسمى وتلطيخها بالأصباغ من أجل التصور وتحديدها مباشرة عن طريق تسلسل N-terminal أو قياس الطيف الكتلي أو الكشف المناعي. يتضمن الاكتشاف المناعي تحديد البروتين من خلال تفاعله مع جسم مضاد معين. من خلال الاستبانة المكانية ، توفر هذه الطريقة معلومات الوزن الجزيئي على البروتينات الفردية وتميز الأشكال الإسوية ومنتجات المعالجة البديلة والأشكال الأخرى المعدلة بعد الترجمة.

2. المبدأ الأساسي لطخة ويسترن

المبدأ الأساسي لللطخة الغربية هو البروتين الكهربائي و ELISA. الرحلان الكهربائي هو طريقة شائعة الاستخدام لفصل البروتينات على أساس الحجم أو الشكل أو الشحنة. Proteins are large molecules with charge, they can migrate in the polyacrylamide gels under electric field. The migrating speed depends on the molecular weight of proteins: heavy proteins move slower than light proteins. This is just like the runners running through a jungle, the polyacrylamide molecule in the gel is like the branches along the sideline, which could slow the runner down. The bulky runner would be affected more by the “branches” than the small runner so that they runs slower. That’s why we could separate those runner proteins. If we load the mixed protein samples on one side of the gel, add a constant electric field on the gel, and let the protein migrating on the gel for a period of time, the mixed protein sample could be separated into different bands on gel (Figure 1). If we put several proteins with known molecular weight under the same electrophoresis condition along with the tested samples as control, we may further measure the molecular weight of proteins within the tested samples by compare the location of sample proteins with control proteins. These control proteins are commonly known as molecular weight marker or protein ladders.

Figure 1. Protein electrophoresis: proteins separated under electric fields based on different molecular weight.

When the proteins were successfully separated, we still use an electric field to transfer the protein bands onto another polyvinylidene fluoride (PVDF) or nitrocellulose (NC) membrane for the following detection. After the proteins band transferred onto PVDF/NC membrane, we use anti specific protein primary antibodies to probe the sample protein, and then use a labeled secondary antibody for further visualization (Figure 2). This procedure is basically an indirect ELISA process (know more about indirect ELISA at ELISA Guide).

Creative Diagnostics provides a variety of high quality primary antibodies and secondary antibodies for western blot use.

Figure 2. Indirect ELISA procedure. To probe and visualize the separated protein bands.

3. The experimental equipment of western blot

As western blot is a very mature technology in molecular biology, there are a full set of commercialized reagent and equipment that support the experiment of WB (Figure 3). Here we list several frequently used tools and materials for western blot:

  1. Gel: usually made of polyacrylamide, need precast before western blot.
  2. Gel comb: used for toothing one side of the gel as sample loading area.
  3. Gel cassette: used for gel formation.
  4. Gel knife: help to move the gel from cassette.
  5. Electrode chamber: used for holding the gel cassette and cathode buffer.
  6. Electrophoresis tank: used for holding the electrode chamber and anode buffer
  7. Power source: provide a constant electric field
  8. Cassette: clamp the multilayer films when doing protein transfer
  9. Sponges: protect the gel and membrane, keep a wet and conductive condition.
  10. Filter paper: protect the gel and membrane, keep a wet and conductive condition.
  11. PVDF/NC membrane: receive the proteins.
  12. Rolling brush: exclude bubbles within the multilayer membrane.
  13. Washing dish: hold the membrane for washing.

Other general equipment such as shaker/incubator for antibody incubation and imager for display the gel result are not listed here but also important for western blot experiment.

Figure 3. Western blot equipments.

Western blot is often used in research to separate and identify proteins. In this technique a mixture of proteins is separated based on molecular weight through gel electrophoresis. These results are then transferred to a membrane producing a band for each protein. The membrane is then incubated with labeled antibodies specific to the protein of interest. The unbound antibody is washed off leaving only the bound antibody to the protein of interest. The bound antibodies are then detected by developing the film. As the antibodies only bind to the protein of interest, only one band should be visible. The thickness of the band corresponds to the amount of protein present thus doing a standard can indicate the amount of protein present. The general process of western blot includes at least 9 steps as following:

Detailed information of each steps are discussed in Western blot protocols.

Although western blot is relatively an old, mature technology, there are still researchers working on it to upgrade this technique. Hughes et al. from University of California (UC) Berkeley, successfully couple western blotting with single-cell analysis, which enables the simultaneous analysis of

2,000 individual cells. Single-cell protein analysis techniques lack resolution, sensitivity or specificity, or require protein tagging. Western blotting avoids these pitfalls but is not amenable to single-cell analysis. This progress enable us use western blot to investigate single cell proteins.

Their array-based technique uses a slide coated with polyacrylamide gel and patterned with thousands of micro wells, into which a cell suspension is seeded by gravity-driven cell settling, resulting in single-cell occupancy in 40–50% of the wells. Intracellular proteins are then solubilized in the wells, subjected to thin-gel electrophoresis and immobilized. Subsequently, the serial stripping and re-probing of antibodies enables multiplexed analyses of proteins.


Antibody Validation

Antibodies are one of the important reagents in life sciences and clinical medicine. Although antibodies have been widely used, there is a lack of established criteria to guide how they should be validated before use. As a result, many commercial antibodies have not been fully validated prior to use and/or lack of further confirmation resulting in failed or unreplicable results, even projects being abandoned, resulting in significant time, money and sample loss. Therefore, the establishment of antibody verification standards has become an urgent need.

What Is Antibody Validation?

Antibody validation consists primarily of the following components: demonstrating specificity (the ability of antibodies to distinguish between different antigens), proving affinity (intensity of antibody binding epitopes), and finally demonstrating reproducibility. However, although this definition of antibody validation is reasonable, there are still some problems with the widespread application or implementation of validation standards.

The task of verifying the antibody should have been done by the antibody supplier. However, although the seller is responsible for the quality of the reagents sold, antibody performance may be affected by a number of other factors. For example, antibodies may change during transport due to improper storage at low temperatures, or although they can be successfully validated in a general biologically relevant system, end users need to use it in their own experimental systems. Therefore, the end user also needs to perform secondary verification of the antibody.

By taking a few small steps, the researcher can effectively reduce the risk of the experiment in subsequent experiments. First, the researcher should be aware of the usage information provided in the product specification, including the application that has been validated for it, the appropriate protocol and the recommended dilution.

How Can Antibodies Be Validated?

There are also different methods for antibody validation for specific applications, including Western blot (WB), immunohistochemistry (IHC), immunocytochemistry (ICC), immunofluorescence (IF), ELISA, immunoprecipitation (IP), chromatin immunoprecipitation. (ChIP) and peptide arrays, etc. In terms of verification, each assay has its advantages and disadvantages (Table 1).

Table 1. Advantages and disadvantages of several antibody validation methods.

فحص مميزات عيب
لطخة ويسترن Easy and simple assay
Ideal for denatured proteins
Difficult to optimize
Time-consuming
A small number of antibodies can be tested per run
ELISA Quantitative assay
High throughput
Does not determine if the antibody is specific or cross-react
IHC/ICC Routinely available and relatively inexpensive Difficult standardization
Epitope accessibility can vary in fixed tissues
Difficult to quantitate
لو High throughput
Easy to optimize
Does not determine if the antibody is specific or cross-reacts
siRNA knockdown KD cell lines can be used in all assays (WB, ICC/IHC, Flow cytometry) KD is transient
Difficult to optimize-requires several siRNA sequences
Knockout cell lines and mouse models Best negative controls, since they guarantee no expression of the target gene
May be used in all assays (WB, ICC/IHC, Flow cytometry)
Cell lines for specific genes are not always available or lethal
KO mouse models take over a year to develop and are often non-viable
السيدة Confirms specificity
High throughput
Requires use of mass spectrometer and trained personnel
SPR Real-time analysis
Label-free
Highly sensitive
Requires immobilization
Requires meticulous experimental design
High sample consumption
MST Rapid assay (KD in 10 min)
Low sample consumption (pM/nM) and small volume (<4 ul)
Immobilization free-in solution measurements
Label-free (optional)
Requires specialized equipment

Which method should be used and how several methods are used to validate antibodies depends not only on sensitivity, specificity and reproducibility, but also on the environment in which the particular antibody is to be used. This means that if a given antibody is only intended for WB, they only need to be tested in this case. However, if you need to use it in other assays, you should also test it again in the application environment. This helps save time and cost associated with the antibody validation process.

Screening for Antibody Specificity

Specificity is a measure of the ability of an antibody to distinguish between different antigens. Even if the antibody may be sensitive to the target protein, it will show a lack of specificity due to cross-reactivity with other proteins. In this sense, it is a basic requirement for a good antibody to confirm that the antibody specifically binds to the target protein.

Several questions need to be identified before analyzing the specificity of a given antibody. The first is what are the types of immunogens that are used to produce this antibody? How is the target protein in the sample to be analyzed constructed? The first question is not easy to answer, especially if the antibody manufacturer does not disclose the type of immunogen. The reason for understanding this information is that the specificity of an antibody depends in part on whether the type of immunogen is a synthetic peptide or a purified protein. Since synthetic peptides do not necessarily summarize the 3-D structure or post-translational modification of native proteins, antibodies produced using synthetic peptides may not recognize native proteins. If the immunogen is a purified protein, the denatured protein is difficult to bind to the antibody. Thus, when the immunogen is a synthetic peptide, the antibody can be applied to WB but not to IP or IHC.

The Preferred Method for Antibody Specific Validation - WB

WB is considered to be the first step in the evaluation of new antibodies because it is the ideal assay for specific validation of denatured protein antibodies. However, in experimental assays where the antigen is in its natural conformation (eg, IHC), it is not the ideal standard method for antibody binding. Because antibodies may recognize a particular epitope in fresh tissue, but different epitopes are recognized in the fixed tissue, the method used to fixed tissue complicates the problem. This happens because unexposed epitopes in natural proteins become accessible after fixed processing and vice versa. If you only need to verify the recognition of the denatured antigen by the antibody or whether it is suitable for WB, then the assay can be used as a first step of verification. The result when the antibody is specific for the selected target is the observation of a band on a target of known molecular weight. If multiple bands are present, they may represent different post-translational modification states, decomposition products or splice variants, or may also be non-specific binding. Therefore, the results of these experiments may appear to be incapable of determining antibody specificity.

Another disadvantage of WB is its low detection throughput because it usually only tests one antibody at a time. However, recently, by converting WB to a capture format, a high-throughput detection method called PAGE-MAP was developed for antibody verification. In this method, a biotinylated protein sample is subjected to PAGE, and then the size-separated protein is incubated with a microsphere-based barcode antibody array for multiplex IP, and the captured protein is labeled with streptavidin for flow through Magnetic cytometry (ie, microsphere affinity) was performed for magnetic bead detection. In addition, size-separated proteins can also be used for parallel readout shotgun mass spectrometry (MS), which can be used to roughly estimate specificity and for selection of antibody target levels sufficient for immunoprecipitation. This new method is powerful, screens thousands of antibodies, recognizes antibodies that bind to the same protein, and provides a means for large-scale antibody validation.

Figure 1. Overview of the western blotting procedure.

In addition to the WB method, the use of blocking peptides to assess antibody specificity is also a common approach, particularly for IHC. These peptides are identical to the peptides used to produce antibodies, and when over-incubated with them, they can be used as immunoneutralizing antibodies. In the validation experiment, the unneutralized antibody was used as a control to stain the sample tissue. If the antibody is specific, incubation with a blocking peptide will result in the disappearance of staining on the tissue. However, this assay has the disadvantage that it does not verify the selectivity of the antibody for the antigen, since the non-specific binding activity of the antibody will also be inhibited by the blocking peptide. Thus, blocking peptides can prove that antibodies are bad, but they do not prove that antibodies must be good.

In the process of antibody validation, the key to demonstrating antibody specificity is the correct use of controls. As in the antibody verification experiments on the cannabinoid CB2 receptor, it has been found that the conventional practice of using only a positive control to verify an antibody is insufficient to ensure the reliability of the antibody. In this validation study, although many techniques (eg, WB, mass spectrometry and blocking peptides) and excellent positive controls were used to obtain a number of positive results indicating the effectiveness of anti-CB2 antibodies. However, when knocking out a negative control to test antibodies, this antibody was found to be non-specific for the CB2 receptor protein. A similar situation may occur due to the similarity of relative epitope regions between proteins, or because antibodies have multiple epitopes. The best negative control is knockout cells/animals that do not express the protein of interest, and closely related proteins can also serve as good negative controls. The best positive control is a cell which non-expression the target protein and transfected with the protein of interest. If knocking out the cells is too difficult to obtain, then siRNA or shRNA knockout cells can be selected as controls. Although negative control is necessary, there is also a need for positive control.

Determination of Antibody Affinity

Antibody binding affinity is another parameter that can be used for antibody validation. It refers to the strength of the binding of an antibody molecule to an epitope. It is usually reported as the equilibrium dissociation constant (KD), which is the ratio of the antibody dissociation rate or kإيقاف (the rate of dissociation from the antigen) to the antibody association rate or antibody binding rate Kتشغيل(the rate of binding to the antibody).

Affinity determination of monoclonal antibodies can be performed with high precision because they are selective only for the same epitope, but in the case of polyclonal antibodies, since the epitopes they detect are heterogeneous and are various A mixture of antibodies with different affinities. Therefore, only the average affinity can be obtained. In order to determine antibody affinity, the following methods have existed. These include ELISA-based methods, as well as other biophysical methods such as microscale thermophoresis (MST) and surface plasmon resonance (SPR).

ELISA is the most popular method for studying antibody affinity. They do not require the use of large amounts of antibodies and antigens, nor do they require purification of the protein. In this method, a fixed concentration of antibody is incubated with the antigen in solution until a steady state is reached. Then, the concentration of the unbound antibody was measured by an indirect ELISA. This method requires prior preliminary experiments to determine the concentration of antibody used within the linear range of the ELISA reaction, and only a small fraction of the total free antibody in the solution remains on the plate (so that the measurement does not significantly affect the equilibrium in the solution).

MST is a biophysical method that detects the affinity of antibody molecules over a wide range of concentrations. It judges the affinity between molecules by measuring the movement of molecules along the infrared laser-induced microscopic temperature gradient. This movement depends on many factors, including the hydrated shell, charge and molecular size. These molecules are initially uniformly distributed in solution and free to diffuse. When the infrared laser is turned on, the unbound molecules usually move out of the heating point. The binding of one molecule to another (such as antibodies and antigens) causes the movement of the entire temperature gradient to change. The movement of the molecule can then be followed by fluorescent labeling to derive affinity parameters for the antibody molecule.

Figure 2. Determination of antibody affinity by Microscale Thermophoresis (MST).

SPR is an optical technique for detecting molecular interactions in which one molecule is immobilized in a metal film and the other molecule is mobile. The combination of these molecules changes the refractive index of the film. Therefore, when polarized light strikes the film, the extinction angle of the light changes and can be monitored by an optical detector (Figure 3).

Figure 3. Determination of antibody affinity by Surface Plasmon Resonance (SPR).

Antibody Reproducibility

Finally, verify the reproducibility of the antibody, which is an essential part of antibody detection. A common misconception in antibody testing is to assume that antibodies produce similar results, whether from the same or different batches or from different manufacturers. One of the most shocking examples is David Rim of Yale University. He developed an antibody-based assay to guide the effective treatment of melanoma and is ready to apply the assay to the clinic. However, when he ordered a new set of antibodies from the same company, he could not reproduce the original results and had to give up his work. That is to say, using antibodies from the same supplier over time, even if only the batch is different, will produce different results. Therefore, it is critical for researchers to always test for antibody repeatability. This becomes especially important when using polyclonal antibodies, as products from the same item number from the supplier may mean different antibodies.

In summary, in order to ensure that the antibody meets the specificity and affinity and reproducibility required for its use, it is necessary to perform a secondary verification strictly according to the antibody detection standard. Only in this way can the reliability of the experimental data be guaranteed.


شاهد الفيديو: مطياف الكتلة (قد 2022).